假單胞菌株M18中rhl菌群傳感系統(tǒng)和調控基因pltR的鑒定及功能研究.pdf

1、熒光假單胞菌(Pseudomonas sp.M18)是從上海郊區(qū)甜瓜根際分離篩選到的一株具有生物防治功能的假單胞菌新種。M18生防作用主要歸功于其可分泌多個抗生物質,包括藤黃綠菌素(pyoluteorin,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)等。本研究試圖在分子水平上鑒定藤黃綠菌素合成相關的生物調控因子,揭示和闡明這些調控因子和藤黃綠菌素生物合成之間的關系。并以這些調控因子為靶向,構

2、建Plt高產工程菌株,提高M18的Plt產量,增強其生物防治能力。本研究主要包括四個方面內容:
　　 第一方面,本課題組利用雙元報告轉座子mini-Tn5 lacZ-ter/1,篩選了若干后期菌群傳感應答基因突變株。與野生型菌株相比,M46-11、M49-2和M58-17的表型具有顯著變化,它們分別具有Plt不產、涌動能力降低和紅色素合成能力缺失的特征。利用分子生物學的方法,鑒定和分析了相應的突變基因,證實M58-17為潛在的菌

3、群傳感突變株。研究過程中還發(fā)現(xiàn),M18菌株能夠分泌高絲氨酸內酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs),其降解(M18/pME6863)或缺失(M58-17)均可以影響抗生素的產量,從而推測AHL類型菌群傳感系統(tǒng)存在于該菌株中,并且可能介入了抗生素生物合成的調控體系。
　　 第二方面,生物信息學分析顯示,藤黃綠菌素生物合成基因簇啟動子區(qū)域存在一個潛在的LuxR家族蛋白作用位點(lux box),表明M18

4、菌株中潛在的菌群傳感(quorum sensing QS)系統(tǒng)可能直接參與了Plt生物合成的調控?；谝酝z傳學分析和突變株58-17突變基因序列分析表明,假單胞菌株M18兼有熒光假單胞和銅綠假單胞菌的遺傳學背景,并且部分的rhl1/基因序列十分相似(相似度99％)。據此設計保守引物,擴增得到M18菌株中的rhlR和rhl1基因。序列分析結果顯示,rhlR和rhl1基因及表達蛋白質序列與銅綠假單胞PAO1(Pseudomonas aer

5、uginosaPAO1)高度相似。因此,M18菌株中的這個菌群傳感系統(tǒng)也命名為rhl菌群傳感系統(tǒng)(RhlR and RhlI)。
　　 慶大霉素抗性基因(Gm)插入突變株M18IG(rhlI：Gm)喪失了合成N-butyryl-homoserine lactone(BHL)和N-hexanoyl-homoserine lactone(HHL)這兩種AHL信號分子的能力,但其Plt產量比野生型提高了5倍,同時抑制另一個抗生物質PC

6、A的生物合成。卡那抗性基因(Km)插入失活rhlR基因后得到突變株M18RK(rhlR：Km),其Plt和PCA合成變化趨勢與突變株M18IG相似。藤黃綠菌素pltLA’-‘lacZ翻譯融合和吩嗪-1-羧酸phzA’-‘lacZ翻譯融合在突變株中的表達情況表明,rhlI和rhlR在基因表達水平上調控這兩種抗生素的生物合成。RhlR和RhlI組成一個有機統(tǒng)一的rhl菌群傳感系統(tǒng),參與調控Plt和PCA生物合成。隨后的信號分子添加實驗又證明

7、,BHL信號分子而非HHL在該調控中發(fā)揮了主導作用。
　　 野生型菌株M18,突變株M18IG和M18RK中pltA基因的mRNA熒光定量PCR分析結果顯示,突變菌株中pltA基因的mRNA水平是野生型的4至5倍。這表明rhl菌群傳感系統(tǒng)負調控Plt生物合成基因簇的轉錄。rhl菌群傳感系統(tǒng)突變菌株中,plt轉錄融合表達質粒pMEAZ-12的表達水平也提高了將近5倍。與此形成鮮明對比的是,另一plt轉錄融合表達質粒pMEAZ-13

8、在rhl菌群傳感系統(tǒng)突變菌株中的表達水平卻和野生型菌株一致。這兩個轉錄融合表達質粒的區(qū)別在于pMEAZ-13比pMEAZ-12少了啟動子和基因編碼區(qū)之間的176 bp間隔序列。這些結果進一步證明了rhl菌群傳感系統(tǒng)在轉錄水平上負調控Plt的生物合成；另一方面也表明,176 bp的間隔序列是調控相關的重要位點。同時也揭示潛在的lux box在此調控過程中并不發(fā)揮所預測的生物學功能。
　　 同時,rhl菌群傳感系統(tǒng)的突變(M18IG

9、和M18RK)促進了ABC(ATP-bindingcassette)轉運基因簇pltHIJKNO的表達,而后者負責轉運分泌Plt而促進Plt的產生。rhlI pltB雙突變菌株M18TI和rhlR pltB雙突變菌株M18TR不再合成Plt,轉運基因簇pltHIJKNO在這兩雙突變菌株中的表達又顯著降低,只有野生型水平的一半。這些結果表明rhl菌群傳感系統(tǒng)必須以Plt為媒介,從而負調控轉運基因簇pltHIJKNO的表達。
　　

10、第三方面,在Plt生物合成基因簇上游鑒定了一個Plt生物合成正調控因子編碼基因pltR。pltR突變株M18TRG和pltR過表達菌株M18(pME6032PLTR)中Plt、PCA的產量以及Plt生物合成基因簇的轉錄結果表明,pltR在轉錄水平上對Plt的生物合成進行路徑特異性的正調控。在rhl菌群傳感系統(tǒng)突變株M18IG和M18RK中,pltR’-‘lacZ翻譯融合表達增加,表明PltR表達受rhl菌群傳感系統(tǒng)負調控,從而后者對藤黃

11、綠菌素生物合成進行負調控。
　　 此外,pltR’-‘lacZ翻譯融合在不同突變株中的差異性表達表明PltR處于Plt生物合成調控體系下游,其介導了GacA/GacS對Plt生物合成的正調控作用,但不介入RsmA對Plt生物合成的負調控作用。Plt本身也不影響pltR基因的表達。
　　 第四方面,在研究藤黃綠菌素和吩嗪-1-羧酸二者生物合成的相互關系時發(fā)現(xiàn),吩嗪-1-羧酸的生物合成在轉錄后水平上抑制了藤黃綠菌素的產生；而