固氮施氏假單胞菌一般氮代謝調(diào)控蛋白Ntrc的功能鑒定.pdf

1、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)A1501是從我國南方水稻根際土壤分離的一株聯(lián)合固氮菌,在微好氧條件下能將空氣中氮氣固定為植物可以吸收利用的銨。但隨著環(huán)境中的氮素含量變化和碳源供應(yīng)不足,其聯(lián)合固氮效率受到很大限制。NtrC蛋白是細菌氮代謝調(diào)控的全局性調(diào)控因子,具有維持生物體細胞碳氮平衡的重要作用。本研究以A1501的ntrC基因為研究對象,構(gòu)建了ntrC基因突變株,對NtrC生物學(xué)功能進行鑒定,同時利用實時熒光定量

2、PCR分析NtrC可能調(diào)控的靶基因的表達,從而初步探討NtrC參與固氮調(diào)控的分子機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1、本文利用同源重組的方法,構(gòu)建含氯霉素抗性盒的重組質(zhì)粒,采用三親結(jié)合的方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入野生型施氏假單胞菌A1501中,經(jīng)同源重組雙交換篩選到ntrC的缺失突變株,命名為ΔntrC。在LB及A15限制性培養(yǎng)基上,ΔntrC均能正常生長。在以硝酸鉀和尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中生存能力下降,表明NtrC直接或間接參與硝酸鹽和尿

3、素吸收代謝途徑的調(diào)控。
　　2、與野生型相比,ΔntrC固氮酶活性下降了90％。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示固氮條件下△ntrC中固氮酶調(diào)節(jié)基因nifLA和結(jié)構(gòu)基因nifHDK的表達量下調(diào)了5倍多。為進一步確定ΔntrC基因的生物學(xué)功能,本研究在ΔntrC中導(dǎo)入cbrB基因,獲得cbrB過量表達株ΔntrC(cbrB),發(fā)現(xiàn)ΔntrC(cbrB)能使ΔntrC的部分固氮酶活性得到恢復(fù)。以上結(jié)果表明,NtrC對固氮酶基因的表達起到重要

4、的作用,同時NtrC與碳代謝調(diào)控蛋白CbrB存在功能上的重疊。
　　3、ΔntrC的趨化和反硝化能力有所下降,表明NtrC直接或間接參與趨化和反硝化途徑中相關(guān)基因的表達調(diào)控。ΔntrC氧脅迫耐受能力增強,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示過氧化氫酶基因katE、過氧化物歧化酶基因sodC顯著上調(diào)。以上結(jié)果說明A1501中NtrC除了調(diào)控氮代謝外,還在其他代謝途徑中有重要作用。
　　4、在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了攜帶質(zhì)粒pE