施氏假單胞菌銨誘導(dǎo)表達(dá)的非編碼RNA AmiR在固氮和反硝化過程中的功能鑒定.pdf

1、細(xì)菌非編碼RNA(ncRNA)，也稱小RNA(sRNA)，一般指長度在50-500 bp之間，不翻譯咸蛋白質(zhì)，但是具有特定功能的RNA分子。常規(guī)獲得ncRNA分子的主要方法包括計算機模擬分析和基于實驗室技術(shù)的Northern blotting，微陣列，RNA測序等。通過RNA測序方法，大量的非編碼RNA在包括大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌（Salmonella）、苜蓿中華根瘤固氮菌(Sinorhizobium m

2、eliloti)、藍(lán)藻細(xì)菌（cyanobacteria）、土拉熱桿菌(Francisella tularensi)，釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、植物病原體白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)等微生物中得到了鑒定。大量的研究表明，在原核生物中，sRNA在菌體的營養(yǎng)代謝、群體感應(yīng)、細(xì)菌毒力和調(diào)整細(xì)菌生理機能以應(yīng)對環(huán)境脅迫等方面發(fā)揮重要作用。非編碼RNA發(fā)揮功能有多種方式，有些非編碼RNA可通過堿

3、基配對的方式與靶標(biāo)mRNAs結(jié)合進(jìn)而影響靶標(biāo)基因的表達(dá)水平或穩(wěn)定性進(jìn)而起調(diào)控作用，比如假單胞菌中報道的鐵調(diào)控RNA prrF;有些非編碼RNA具有蛋白結(jié)合能力，可通過與靶標(biāo)蛋白的高親和結(jié)合進(jìn)而競爭蛋白與其靶標(biāo)的結(jié)合參與蛋白的調(diào)控活性，研究較為深入的有碳代謝抑制調(diào)控的非編碼RNA CrcYZ，次級代謝物調(diào)控的rsm YZ等。在固氮微生物中，非編碼RNA的研究也有大量報道，但是直接參與固氮基因表達(dá)調(diào)控的例子不多。2016年本實驗室報道了一個

4、可特異結(jié)合固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifKmRNA并參與固氮酶活性調(diào)控的非編碼RNA nfiS,但是是否有其他的非編碼RNA也參與了固氮系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)控值得進(jìn)一步的研究。
　　施氏假單胞菌A1501分離自水稻根際，能夠定殖在根表或通過傷口入侵到水稻根組織進(jìn)行聯(lián)合固氮。該菌具有固氮、促生、耐鹽等優(yōu)良性能，在非豆科作物節(jié)肥增產(chǎn)方面具有重要的應(yīng)用價值。為了獲得施氏假單胞菌A1501在固氮條件下表達(dá)的非編碼RNA信息，我們測定了該菌在固氮條件(0.1

5、mM NH4+，0.5％ O2)和銨抑制條件(20mM NH4+，0.5％O2)下的轉(zhuǎn)錄組。轉(zhuǎn)錄組分析共發(fā)現(xiàn)了53個特異表達(dá)的非編碼RNA，相比銨抑制條件，17個sRNA在固氮條件下表達(dá)顯著上調(diào)，6個sRNA在固氮條件下被抑制。編號為ncRNA31的非編碼RNA在固氮條件下表達(dá)水平上調(diào)了93倍，基因組中位于保守蛋白質(zhì)PST1955(編碼“亞硝酸還原酶(NAD(P)H))亞基，NirD）和PST1956(編碼“氰鈷胺素生物合成的蛋白質(zhì)”)

6、之間。通過BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)與GenBank數(shù)據(jù)庫比較，發(fā)現(xiàn)該ncRNA在施氏假單胞菌中高度保守，而且其兩側(cè)的基因也非常保守。由于該ncRNA在固氮條件下高表達(dá)，而且特異響應(yīng)外界銨離子信號，將其命名為amiR(ammonium induced ncRNA)。
　　通過northern blotting證實了總RNA中amiR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在。進(jìn)一步的5'-RACE實驗表明A

7、miR與兩測基因反方向轉(zhuǎn)錄，同時確認(rèn)了amiR的轉(zhuǎn)錄起始位點。對amiR的啟動子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了氮代謝關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點蛋白ntrC和rpoN的保守結(jié)合位點;采用qRT-PCR對amiR的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，與野生型相比，在氮代謝關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點蛋白ΔntrC和ΔrpoN的突變株中amiR的表達(dá)顯著下調(diào)。由此推測，amiR可能是A1501菌氮代謝調(diào)控系統(tǒng)的重要組成部分，受ntrC和rpoN的直接調(diào)控。
　　為了研究amiR的生物學(xué)

8、功能，構(gòu)建了amiR的缺失突變株ΔamiR，過表達(dá)菌株以及回補菌株。對野生型、突變株和回補菌株的相關(guān)表型進(jìn)行了測定，主要包括:在LB和基本培養(yǎng)基中生長情況、固氮酶活性、反硝化作用、細(xì)菌運動、氧化和滲透脅迫、鹽脅迫、生物膜形成等。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比野生型，ΔamiR菌株的耐氧化、滲透壓力和鹽耐受性與野生型相比較沒有明顯改變，但是ΔamiR的固氮酶活性下降了30％，這表明amiR在A1501菌的生物固氮過程中起重要作用。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，與

9、野生型相比，當(dāng)硝酸鹽作為電子受體進(jìn)行反硝化生長時，ΔamiR的生長能力減少約30％，當(dāng)亞硝酸鹽作為電子受體時，ΔamiR突變株幾乎喪失反硝化作用。采用實時定量測定了固氮酶編碼基因nifHDK的表達(dá)，結(jié)果表明固氮基因不受amiR基因突變的影響。進(jìn)一步測定了野生型和突變株胞內(nèi)的能量信號NADPH的水平，發(fā)現(xiàn)ΔamiR突變株中NADPH的下降顯著。以上數(shù)據(jù)表明，amiR不僅在固氮過程中發(fā)揮作用，在另一種氮同化過程反硝化中也發(fā)揮重要作用。ami

10、R突變對固氮系統(tǒng)的影響不是發(fā)生在固氮酶基因轉(zhuǎn)錄水平，可能是由于能量合成受阻造成的，其作用機制值得進(jìn)一步深入研究。
　　為闡明施氏假單胞菌A1501中amiR參與固氮基因表達(dá)調(diào)控的具體機制和作用方式，我們對野生型菌株及ΔamiR突變株在固氮條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，與野生型相比，在4278個基因中，突變株中總共有416個基因表達(dá)發(fā)生顯著上升或下調(diào)，這些基因大多數(shù)參與反硝化過程和能量轉(zhuǎn)移過程，固氮基因的表達(dá)沒有

11、顯著變化，這表明amiR在反硝化和能量轉(zhuǎn)換過程中扮演了重要角色。在ΔamiR缺失突變體中，其側(cè)翼基因亞硝酸鹽還原酶基因nirD的表達(dá)水平顯著下調(diào)，該基因是反硝化途徑中的重要結(jié)構(gòu)基因。為了確認(rèn)nirD與amiR缺失造成表型之間的關(guān)聯(lián)，構(gòu)建了nirD的缺失突變株ΔnirD。進(jìn)一步測定和比較了ΔamiR和ΔnirD兩個突變株的表型，結(jié)果表明ΔamiR與ΔnirD在固氮酶活、反硝化過程中有相似的表型，由此推測本研究發(fā)現(xiàn)的amiR缺失造成的表型可

12、能與下游基因nirD的表達(dá)模式相關(guān)。關(guān)于amiR的作用機制提出兩種假設(shè)，一種是amiR是nirD基因的順式作用元件，也就是nirD可能為amiR的作用靶標(biāo)，第二種假設(shè)為由于amiR編碼區(qū)與nirD基因的啟動區(qū)靠近，amiR突變造成了對nirD表達(dá)的影響。圍繞以上兩種假設(shè)正在開展進(jìn)一步的分析和驗證。
　　RNA分子的二級結(jié)構(gòu)與非編碼RNA發(fā)揮調(diào)控功能高度相關(guān)，而且二級結(jié)構(gòu)的特征可進(jìn)一步用于預(yù)測非編碼RNA的作用靶標(biāo)。本研究采用RNA

13、Fold軟件預(yù)測了AmiR的二級結(jié)構(gòu)，用TARGETRNA2軟件預(yù)測了AmiR的靶標(biāo)基因。結(jié)果表明在AmiR的二級結(jié)構(gòu)中存在多個長度在25-63nt之間的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。這些預(yù)測的頸環(huán)結(jié)構(gòu)跟多個mRNA的部分序列互補配對，但是這些頸環(huán)結(jié)構(gòu)是否與AmiR缺失引起的表型直接相關(guān)以及其具體的作用靶標(biāo)確定仍需進(jìn)一步的實驗證實。我們嘗試在體外對該sRNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和純化，并通過圓二色譜測定了處在不同的緩沖液中的AmiR的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，在不同的鹽濃度