施氏假單胞菌銨誘導表達的非編碼RNA AmiR在固氮和反硝化過程中的功能鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、細菌非編碼RNA(ncRNA),也稱小RNA(sRNA),一般指長度在50-500 bp之間,不翻譯咸蛋白質(zhì),但是具有特定功能的RNA分子。常規(guī)獲得ncRNA分子的主要方法包括計算機模擬分析和基于實驗室技術的Northern blotting,微陣列,RNA測序等。通過RNA測序方法,大量的非編碼RNA在包括大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)、苜蓿中華根瘤固氮菌(Sinorhizobium m

2、eliloti)、藍藻細菌(cyanobacteria)、土拉熱桿菌(Francisella tularensi),釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、植物病原體白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)等微生物中得到了鑒定。大量的研究表明,在原核生物中,sRNA在菌體的營養(yǎng)代謝、群體感應、細菌毒力和調(diào)整細菌生理機能以應對環(huán)境脅迫等方面發(fā)揮重要作用。非編碼RNA發(fā)揮功能有多種方式,有些非編碼RNA可通過堿

3、基配對的方式與靶標mRNAs結合進而影響靶標基因的表達水平或穩(wěn)定性進而起調(diào)控作用,比如假單胞菌中報道的鐵調(diào)控RNA prrF;有些非編碼RNA具有蛋白結合能力,可通過與靶標蛋白的高親和結合進而競爭蛋白與其靶標的結合參與蛋白的調(diào)控活性,研究較為深入的有碳代謝抑制調(diào)控的非編碼RNA CrcYZ,次級代謝物調(diào)控的rsm YZ等。在固氮微生物中,非編碼RNA的研究也有大量報道,但是直接參與固氮基因表達調(diào)控的例子不多。2016年本實驗室報道了一個

4、可特異結合固氮酶結構基因nifKmRNA并參與固氮酶活性調(diào)控的非編碼RNA nfiS,但是是否有其他的非編碼RNA也參與了固氮系統(tǒng)的表達調(diào)控值得進一步的研究。
  施氏假單胞菌A1501分離自水稻根際,能夠定殖在根表或通過傷口入侵到水稻根組織進行聯(lián)合固氮。該菌具有固氮、促生、耐鹽等優(yōu)良性能,在非豆科作物節(jié)肥增產(chǎn)方面具有重要的應用價值。為了獲得施氏假單胞菌A1501在固氮條件下表達的非編碼RNA信息,我們測定了該菌在固氮條件(0.1

5、mM NH4+,0.5% O2)和銨抑制條件(20mM NH4+,0.5%O2)下的轉錄組。轉錄組分析共發(fā)現(xiàn)了53個特異表達的非編碼RNA,相比銨抑制條件,17個sRNA在固氮條件下表達顯著上調(diào),6個sRNA在固氮條件下被抑制。編號為ncRNA31的非編碼RNA在固氮條件下表達水平上調(diào)了93倍,基因組中位于保守蛋白質(zhì)PST1955(編碼“亞硝酸還原酶(NAD(P)H))亞基,NirD)和PST1956(編碼“氰鈷胺素生物合成的蛋白質(zhì)”)

6、之間。通過BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)與GenBank數(shù)據(jù)庫比較,發(fā)現(xiàn)該ncRNA在施氏假單胞菌中高度保守,而且其兩側的基因也非常保守。由于該ncRNA在固氮條件下高表達,而且特異響應外界銨離子信號,將其命名為amiR(ammonium induced ncRNA)。
  通過northern blotting證實了總RNA中amiR轉錄產(chǎn)物的存在。進一步的5'-RACE實驗表明A

7、miR與兩測基因反方向轉錄,同時確認了amiR的轉錄起始位點。對amiR的啟動子進行分析,發(fā)現(xiàn)了氮代謝關鍵調(diào)控節(jié)點蛋白ntrC和rpoN的保守結合位點;采用qRT-PCR對amiR的表達特性進行了分析,結果表明,與野生型相比,在氮代謝關鍵調(diào)控節(jié)點蛋白ΔntrC和ΔrpoN的突變株中amiR的表達顯著下調(diào)。由此推測,amiR可能是A1501菌氮代謝調(diào)控系統(tǒng)的重要組成部分,受ntrC和rpoN的直接調(diào)控。
  為了研究amiR的生物學

8、功能,構建了amiR的缺失突變株ΔamiR,過表達菌株以及回補菌株。對野生型、突變株和回補菌株的相關表型進行了測定,主要包括:在LB和基本培養(yǎng)基中生長情況、固氮酶活性、反硝化作用、細菌運動、氧化和滲透脅迫、鹽脅迫、生物膜形成等。測定結果發(fā)現(xiàn),相比野生型,ΔamiR菌株的耐氧化、滲透壓力和鹽耐受性與野生型相比較沒有明顯改變,但是ΔamiR的固氮酶活性下降了30%,這表明amiR在A1501菌的生物固氮過程中起重要作用。此外,研究也發(fā)現(xiàn),與

9、野生型相比,當硝酸鹽作為電子受體進行反硝化生長時,ΔamiR的生長能力減少約30%,當亞硝酸鹽作為電子受體時,ΔamiR突變株幾乎喪失反硝化作用。采用實時定量測定了固氮酶編碼基因nifHDK的表達,結果表明固氮基因不受amiR基因突變的影響。進一步測定了野生型和突變株胞內(nèi)的能量信號NADPH的水平,發(fā)現(xiàn)ΔamiR突變株中NADPH的下降顯著。以上數(shù)據(jù)表明,amiR不僅在固氮過程中發(fā)揮作用,在另一種氮同化過程反硝化中也發(fā)揮重要作用。ami

10、R突變對固氮系統(tǒng)的影響不是發(fā)生在固氮酶基因轉錄水平,可能是由于能量合成受阻造成的,其作用機制值得進一步深入研究。
  為闡明施氏假單胞菌A1501中amiR參與固氮基因表達調(diào)控的具體機制和作用方式,我們對野生型菌株及ΔamiR突變株在固氮條件下的轉錄組進行了分析。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示,與野生型相比,在4278個基因中,突變株中總共有416個基因表達發(fā)生顯著上升或下調(diào),這些基因大多數(shù)參與反硝化過程和能量轉移過程,固氮基因的表達沒有

11、顯著變化,這表明amiR在反硝化和能量轉換過程中扮演了重要角色。在ΔamiR缺失突變體中,其側翼基因亞硝酸鹽還原酶基因nirD的表達水平顯著下調(diào),該基因是反硝化途徑中的重要結構基因。為了確認nirD與amiR缺失造成表型之間的關聯(lián),構建了nirD的缺失突變株ΔnirD。進一步測定和比較了ΔamiR和ΔnirD兩個突變株的表型,結果表明ΔamiR與ΔnirD在固氮酶活、反硝化過程中有相似的表型,由此推測本研究發(fā)現(xiàn)的amiR缺失造成的表型可

12、能與下游基因nirD的表達模式相關。關于amiR的作用機制提出兩種假設,一種是amiR是nirD基因的順式作用元件,也就是nirD可能為amiR的作用靶標,第二種假設為由于amiR編碼區(qū)與nirD基因的啟動區(qū)靠近,amiR突變造成了對nirD表達的影響。圍繞以上兩種假設正在開展進一步的分析和驗證。
  RNA分子的二級結構與非編碼RNA發(fā)揮調(diào)控功能高度相關,而且二級結構的特征可進一步用于預測非編碼RNA的作用靶標。本研究采用RNA

13、Fold軟件預測了AmiR的二級結構,用TARGETRNA2軟件預測了AmiR的靶標基因。結果表明在AmiR的二級結構中存在多個長度在25-63nt之間的頸環(huán)結構。這些預測的頸環(huán)結構跟多個mRNA的部分序列互補配對,但是這些頸環(huán)結構是否與AmiR缺失引起的表型直接相關以及其具體的作用靶標確定仍需進一步的實驗證實。我們嘗試在體外對該sRNA進行體外轉錄和純化,并通過圓二色譜測定了處在不同的緩沖液中的AmiR的結構,結果表明,在不同的鹽濃度

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