施氏假單胞菌碳代謝抑制蛋白Crc的功能鑒定及其固氮條件下的全局調(diào)控機(jī)制.pdf

1、當(dāng)生長介質(zhì)中存在多種碳源時,細(xì)菌通常利用優(yōu)先碳源,同時抑制其它碳源的代謝而達(dá)到最佳生長,這種現(xiàn)象稱為碳代謝物抑制。不同細(xì)菌的碳代謝物抑制調(diào)節(jié)機(jī)制和調(diào)控蛋白存在差異,主要通過在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平發(fā)揮作用。Crc蛋白是假單胞菌碳代謝調(diào)控的全局性調(diào)控因子,其在聯(lián)合固氮菌施氏假單胞中的研究未見報道。本研究通過突變株構(gòu)建、代謝譜分析、酶活測定等方法分析Crc在苯甲酸代謝和固氮過程中的生物學(xué)功能；同時利用表達(dá)譜技術(shù)研究Crc轉(zhuǎn)錄組,分析碳氮偶聯(lián)調(diào)控

2、中Crc可能的靶基因,從而探討Crc參與固氮調(diào)控的分子機(jī)制。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 基因組分析表明,固氮施氏假單胞菌A1501擁有一個與銅綠假單胞菌crc高度同源的基因,氨基酸序列一致性達(dá)88％。通過三親結(jié)合的方法構(gòu)建了crc基因的缺失突變株。突變株在LB及A15限制培養(yǎng)基都能正常生長。當(dāng)葡萄糖與苯甲酸同時存在時,突變株中葡萄糖抑制苯甲酸的能力下降。實(shí)時定量RT-PCR證明,在混合碳源培養(yǎng)條件下,突變株中苯甲酸和鄰苯二酚

3、降解的關(guān)鍵基因bend和catB相比野生型分別上調(diào)50和25倍,說明Crc影響了混合碳源中的芳香族化合物的降解,表現(xiàn)出碳代謝物抑制的調(diào)控功能。Biolog實(shí)驗(yàn)表明突變株對α-D-葡萄糖和葡萄糖酸等碳源的利用能力顯著增強(qiáng)。此外,我們還發(fā)現(xiàn)Crc的突變影響了細(xì)菌的趨化能力,說明A1501中Crc的功能是多樣的,除了影響碳源利用外,還對其他的某些途徑存在著調(diào)節(jié)作用。
　　 與野生型相比,突變株的固氮酶活降低了30％。RT-PCR結(jié)果顯

4、示固氮條件下突變株中固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifH的表達(dá)量下調(diào)了30多倍。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了nifH基因的啟動子與lacZ的融合載體,并檢測報告基因lacE,的表達(dá)活性,結(jié)果表明,固氮條件下突變株中nifH基因的啟動子活性只有野生型菌中的1／5到1／3。以上結(jié)果提示我們,在固氮施氏假單胞菌A1501菌中Crc可能通過某種尚未發(fā)現(xiàn)的方式影響了固氮基因的表達(dá),這個現(xiàn)象在其他微生物中從未報道。
　　 為了研究Crc在固氮條件下的全局性調(diào)控機(jī)制,

5、通過高通量測序手段對野生型和突變株在固氮條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測定。轉(zhuǎn)錄組分析表明crc突變株與野生型相比共有498個基因轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出顯著差異(變化倍數(shù)大于2),其中108個基因表達(dá)明顯上調(diào),而390個基因的表達(dá)受到顯著抑制,表明這些基因受crc的直接或間接影響。變化最明顯的基因主要是與能量產(chǎn)生及轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因,碳源轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)基因,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝基因以及無機(jī)離子代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因等。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)A1501固氮島內(nèi)59個固氮基因中有