固氮施氏假單胞菌鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur參與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和固氮調(diào)控的研究.pdf

1、鐵是微生物代謝重要的金屬元素，但過量的鐵會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此微生物對(duì)胞內(nèi)鐵平衡存在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控。革蘭氏陰性菌中，胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存和利用主要由鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur（ferric uptake regulator）調(diào)控。研究表明Fur參與了根際微生物、病原微生物的宿主定殖、侵染等生理過程，但關(guān)于Fur蛋白是否直接參與生物固氮調(diào)控未見報(bào)道。施氏假單胞菌A1501是一株根際聯(lián)合固氮菌，其高效固氮及根表定殖需要大量含鐵蛋白的參與。A1501基因組

2、擁有一個(gè)與銅綠假單胞菌fur高度同源的基因。本研究通過一系列的分子生物學(xué)方法明確了該菌中Fur的功能及信號(hào)響應(yīng)機(jī)制，并初步探索了其參與鐵吸收和生物固氮調(diào)控的分子機(jī)制。取得以下主要研究結(jié)果：
　　(1)A1501菌fur的表達(dá)受環(huán)境中鐵離子濃度及RpoS的影響。通過實(shí)時(shí)定量和Western雜交的方法測(cè)定了A1501菌fur基因的表達(dá)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常條件相比，在缺鐵情況下fur的表達(dá)量提高1倍；而在高鐵環(huán)境中fur表達(dá)僅為正常條

3、件的50％左右，表明fur表達(dá)情況與環(huán)境中鐵濃度密切相關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在rpoS突變株中fur基因與Fur蛋白的表達(dá)量均上調(diào)約2倍，表明Fur的表達(dá)受RpoS的調(diào)控。
　　(2)A1501菌中Fur參與了鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)調(diào)控。在LB中，fur突變株的生長能力與野生型相比無顯著差異。ICP-MS技術(shù)測(cè)定胞內(nèi)鐵離子濃度，結(jié)果表明，突變株內(nèi)鐵含量為野生型的1.3倍，表明Fur參與了胞內(nèi)的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)。qRT-PCR分析結(jié)果表明，與野生型

4、相比鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因上調(diào)至少8倍，A1501菌中Fur對(duì)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因存在負(fù)調(diào)控。此外，fur通過對(duì)非編碼RNA prrF的調(diào)控作用參與了菌體對(duì)氧化沖擊的響應(yīng)，影響了sodB的表達(dá)。EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Fur蛋白與prrF的啟動(dòng)子存在體外結(jié)合。
　　（3)fur基因參與了A1501的固氮基因表達(dá)調(diào)控。fur突變株的固氮酶活只有野生型的10%左右。突變株中固氮酶編碼基因表達(dá)下調(diào)，固氮酶蛋白水平顯著下降，表明Fur對(duì)固氮基因的表達(dá)具有調(diào)控作用

5、。對(duì)野生型和Fur突變株在固氮條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，突變株固氮島內(nèi)的48個(gè)固氮相關(guān)基因全部表達(dá)下調(diào)，而參與一般氮代謝調(diào)控系統(tǒng)的rpoN、ntrBC等基因的表達(dá)量沒有顯著的變化。其中固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifHDK等啟動(dòng)子區(qū)存在可能的Fur的結(jié)合位點(diǎn)，通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證明Fur蛋白與nifHDK的啟動(dòng)子存在體外結(jié)合現(xiàn)象。
　　綜上，在A1501菌中，F(xiàn)ur蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有DNA結(jié)合能力。Fur自身的表達(dá)受環(huán)境中鐵