巴西固氮螺菌Sp7中鐵受體蛋白FhuE和雜合雙組分蛋白Org35功能分析.pdf

1、巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)是一種聯(lián)合固氮菌，主要定殖在禾本科作物根際表面。在巴西固氮螺菌中，NifA蛋白是所有固氮基因(nif基因)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白。但在該菌中，既沒有發(fā)現(xiàn)類似FixL/FixJ雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，也沒有發(fā)現(xiàn)NifL蛋白。因此本實驗室以NifA蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從巴西固氮螺菌染色體DNA文庫中篩選與NifA蛋白有直接相互作用的蛋白，共獲得4個相關(guān)蛋白。本研究對其中兩個蛋白FhuE和

2、Org35功能研究。 fhuE基因編碼的蛋白與Escherichiacoli中的鐵受體蛋白FhuE蛋白具有很高的同源性，同源性高達57％。E.coli的FhuE蛋白是氧化肟型鐵載體的受體蛋白，負責糞原因子形式鐵載體的運輸。本研究表明，A.brasilenseSp7的fhuE基因編碼糞原因子形式鐵載體的鐵受體蛋白，負責糞原因子的吸收利用。 Org35是個雜合的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，包含三個結(jié)構(gòu)區(qū)域，即PAS結(jié)構(gòu)域(PAS)、

3、組氨酸蛋白激酶區(qū)域(HPK)、響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白區(qū)域(RR)。PAS結(jié)構(gòu)域主要存在于一些直接或間接參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)中，充當傳感器區(qū)域，感受外界環(huán)境的變化。PAS結(jié)構(gòu)域廣泛地存在于雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)當中，是感受信號的重要方式。本研究通過Org35和NifA在Ecoli中共同表達、純化。在蛋白水平上，證明了Org35和NifA存在互作，并且Org35通過PAS結(jié)構(gòu)域與NifA相互作用。本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)證明HPK和RR區(qū)域存在相互作用。

4、 在Ecoli中分別表達和純化了Org35、Org35-HPK、Org35-RR蛋白。蛋白磷酸化實驗表明Org35的組氨酸蛋白激酶區(qū)域能夠自我磷酸化，并且能夠?qū)⒘姿峄鶊F傳遞給響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白區(qū)域。結(jié)果表明Org35的HPK區(qū)域和RR區(qū)域分別行使了組氨酸蛋白激酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的功能。從生化水平上，證實Org35是一個雜合雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。 進一步研究表明，Org35蛋白參與細菌的生長和趨化，與細菌的趨氧、趨光、鞭毛形態(tài)、運動