深海細(xì)菌Shewanella piezotolerans WP3鐵離子調(diào)控因子—Fur調(diào)控蛋白功能研究.pdf

1、深海是一個(gè)特殊的生態(tài)環(huán)境，這里不僅低溫、高壓、黑暗、寡營(yíng)養(yǎng)，而且氧氣濃度也較低。深海特殊的生態(tài)環(huán)境造就了生活在該環(huán)境下生物的特異生理代謝特性，研究該生態(tài)系統(tǒng)下的微生物的生理特性，對(duì)于了解極端微生物的生活特性，極端微生物資源的開發(fā)利用具有重要的意義。 本文所研究的細(xì)菌Shewanella piezotolerans WP3為一株分離自西太平洋1914米深海沉積物中的一株革蘭氏陰性菌。WP3為一桿狀的兼性厭氧菌，屬于r-proteo

2、bacterium，具有55個(gè)編碼細(xì)胞色素C的基因，比Shewanella oneidensisMR-1(42個(gè)編碼細(xì)胞色素C基因)多13個(gè)。在有氧培養(yǎng)條件下，WP3的菌體呈現(xiàn)淡紫色，同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明這些細(xì)胞色素C在有氧條件下也具有一定程度的轉(zhuǎn)錄。這個(gè)結(jié)果表明即使在有氧條件下，WP3的厭氧呼吸途徑也在起作用并為其提供生命活動(dòng)所必須的能量來(lái)源。這些細(xì)胞色素C很可能對(duì)WP3適應(yīng)低氧氣濃度這一深海特異的生長(zhǎng)環(huán)境因子具有重要的生

3、理學(xué)意義。如何維持好細(xì)胞內(nèi)的Fe離子濃度的平衡對(duì)于所有的細(xì)菌均具有重要的生理意義：一方面，生命活動(dòng)離不開鐵離子。鐵離子是一些功能蛋白的結(jié)構(gòu)組成成分，如異檸檬酸脫氫酶亞基中的Fe-S結(jié)構(gòu)域，它還是細(xì)胞內(nèi)重要代謝的催化因子如DNA代謝，TCA循環(huán)，糖酵解等都離不開鐵離子的參與；另一方面，鐵離子尤其是還原態(tài)的二價(jià)鐵離子濃度過(guò)高容易通過(guò)Feton Reaction導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷。WP3的特意的生理特性及其所生活的環(huán)境決定了研究WP3中Fur

4、如何調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平更具重要意義。一方面，WP3相對(duì)于普通細(xì)菌，需要更多的鐵離子。WP3所具有的特異的厭氧呼吸途徑上的大量細(xì)胞色素C的成熟需要大量的鐵離子的參與，不僅如此WP3能夠以Fe3+作為最終電子受體進(jìn)行厭氧呼吸。另一方面，WP3所處的原生活環(huán)境中可直接利用的鐵離子濃度低，鐵離子一般以固態(tài)化合物形式大量存在于深海沉積物中而非海水中。與鐵離子的存在形式相反，硫酸鹽在深海環(huán)境中的濃度高。所以深海是一個(gè)低可溶性鐵離子高硫酸鹽的特異生

5、理環(huán)境。Fur是存在于大部分細(xì)菌中的調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Fe離子濃度平衡的一個(gè)調(diào)控因子，具有多樣的調(diào)控方式對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。同樣在WP3基因組中，我們也找到了一個(gè)fur基因。為了研究WP3的鐵離子平衡調(diào)控，我們構(gòu)建了一株fur基因缺失突變的WP3，簡(jiǎn)稱Fur。通過(guò)基因芯片研究我們發(fā)現(xiàn)在WP3中該基因具有重要生理作用，該基因的刪除導(dǎo)致了大量基因的差異表達(dá)。Fur的基因芯片結(jié)果與低Fe離子濃度培養(yǎng)的基因芯片結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)：雖然這兩個(gè)芯片實(shí)驗(yàn)的數(shù)

6、據(jù)中差異表達(dá)的基因中與鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)方向具有較好的一致性，證明Fur在WP3中主要起調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵離子平衡的作用。但是還有大量的基因在這兩組數(shù)據(jù)中表達(dá)的方向相反，表明fur的缺失突變與缺鐵培養(yǎng)所造成WP3的生理狀態(tài)具有較大的差異。通過(guò)分析，我們發(fā)現(xiàn)很可能是細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度的不一樣造成。與其他菌株的Fur調(diào)控因子缺失突變結(jié)果相似，H2O2的耐受性實(shí)驗(yàn)中Fur存活率大大低于野生WP3，表明了Fur細(xì)胞內(nèi)過(guò)高Fe2+濃度導(dǎo)致更加劇烈

7、的FetonReaction反應(yīng)進(jìn)而殺傷細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Fe2+濃度，我們發(fā)現(xiàn)fur的缺失突變的確導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平的上升。 本研究通過(guò)檢測(cè)fur突變株的厭氧代謝生長(zhǎng)狀況發(fā)現(xiàn)fur的刪除突變?cè)斐蓞捬鹾粑俾适艿接绊?。這是首次發(fā)現(xiàn)fur的刪除突變會(huì)影響到希瓦氏屬細(xì)菌的厭氧呼吸速率。通過(guò)基因芯片數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)這很可能是由于血紅素合成途徑，及細(xì)胞色素C成熟途徑上的基因下調(diào)。我們比較了fur突變株與野生WP3厭氧條件下的細(xì)胞