水稻類病變調(diào)控因子OsSF3b3的蛋白研究.pdf

1、植物類病變(lesion mimic)是指一類在沒有病原物入侵的情況下就會自發(fā)產(chǎn)生細胞死亡的突變體，往往是由抗病或凋亡相關(guān)基因突變而至，而造成植株防御系統(tǒng)被激活、正常生理代謝紊亂、細胞提前衰老死亡等。水稻類病變spl5突變體會自發(fā)產(chǎn)生葉片細胞的壞死，且植株顯著增強了對稻瘟病、白葉枯病等的抗性。在前期的研究工作中，我們課題組利用“圖位克隆”技術(shù)克隆了調(diào)控水稻spl5類病變壞死表型的基因，發(fā)現(xiàn)SPL5編碼的蛋白與人的剪接因子SF3(spli

2、cefactor3)的一個亞基SF3b3同源。由于人的SF3因子是一個多聚蛋白復合體，我們推測在水稻中也很可能存在與SPL5（即OsSF3b3）互作的蛋白，這些蛋白一起參與類病變的調(diào)控，因此本研究對OsSF3b3的互作蛋白進行篩選和分析。首先，利用同源克隆方法，從水稻中克隆了與人SF3蛋白復合體同源的OsSF3b1、OsSF3b2、OsSF3b4和OsSF3b5亞基，并通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)OsSF3b3的CPSF_A結(jié)構(gòu)域分別與OsS

3、F3b2、OsSF3b5存在互作關(guān)系。為了進一步分析OsSF3b3的互作蛋白，我們構(gòu)建了OsSF3b3∶His融合的原核表達載體，在BL21菌株中經(jīng)IPTG誘導后，提取的蛋白在SDS-PAGE電泳中獲得了一條與OsSF3b3蛋白大小相近的條帶;同時，構(gòu)建了OsSF3b3∶GST融合的過表達載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化到了水稻日本晴愈傷組織中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，通過載體特異序列的PCR檢測和OsSF3b3基因表達的RT-PCR分析，篩選得了高表