水稻OsSPX4蛋白調(diào)控磷中心調(diào)控因子OsPHR2的機(jī)制研究.pdf

1、擬南芥（Arabidopsis thaliana）中系統(tǒng)磷信號(hào)與磷平衡受中心調(diào)控因子AtPHR1及其部分功能互補(bǔ)的家族成員AtPHL1調(diào)控，它是一類具M(jìn)YB-CC結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。AtPHR1在植物中具有功能的保守性，它在水稻中的同源基因OsPHR2是水稻調(diào)控缺磷脅迫響應(yīng)的中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)，水稻體內(nèi)有6個(gè)僅包含SPX結(jié)構(gòu)域的蛋白，除了OsSPX4之外，其余5個(gè)基因均受缺磷誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)OsSPX4蛋白同其它Os

2、SPX蛋白相比具有不同的功能機(jī)制。水稻spx4突變體中，植株地上部分磷積累，缺磷向應(yīng)基因表達(dá)顯著上調(diào)。反之，在OsSPX4的過表達(dá)植株OxSPX4中，缺磷響應(yīng)基因表達(dá)受到抑制。
　　通過分析OsSPX4與OsPHR2雙過表達(dá)材料（記為OxSPX4/OxPHR2），發(fā)現(xiàn)在雙過表達(dá)材料中，OxSPX4回復(fù)了OxPHR2材料在正常磷條件下地上部磷積累和磷信號(hào)上調(diào)的表型，使磷濃度和磷信號(hào)回復(fù)到了野生型水平，表明OsSPX4具有負(fù)調(diào)控OsP

3、HR2功能的作用。
　　分析OsSPX4p-OsSPX4-G US和OsSPX4p-OsSPX4-GFP轉(zhuǎn)基因融合材料顯示，OsSPX4蛋白在缺磷條件下，蛋白量顯著下調(diào)。同時(shí)，在體內(nèi)缺磷條件下OsSPX4蛋白的半衰期顯著變短，表明缺磷條件加速OsSPX4蛋白的降解。利用體外降解體系，對(duì)GST-SPX4蛋白的體外穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明缺磷條件下GST-SPX4蛋白的降解加快，半衰期變短。但體外添加10 mM和25 mM磷酸鹽(Na

4、H2PO4，Pi)以及25mM亞磷酸鹽（NaHPO3，Phi）時(shí)，GST-SPX4蛋白的穩(wěn)定性有較大程度提高。與此同時(shí)，體外添加N(NaNO3)和S(Na2SO4)對(duì)GST-SPX4蛋白的穩(wěn)定性沒有影響，說明Pi提高OsSPX4蛋白的穩(wěn)定性具有特異性。
　　利用酵母雙雜交以及免疫共沉淀等技術(shù)研究表明OsSPX4與OsPHR2可在體內(nèi)和體外進(jìn)行互作，OsSPX4中包含有SPX結(jié)構(gòu)域的N端，以及OsPHR2中包含有MYB和CC結(jié)構(gòu)的C

5、端是兩個(gè)蛋白的互作結(jié)構(gòu)域。通過染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，Chip）以及凝膠阻滯電泳(ElectrophoreticMobility Shift Assay, EMSA)進(jìn)行體內(nèi)和體外分析發(fā)現(xiàn)，OsSPX4蛋白通過與OsPHR2的互作，影響OsPHR2與其下游結(jié)合基因啟動(dòng)子的P1BS(PHR1 BindingSequence)元件的結(jié)合。
　　采用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(Bimolec

6、ular fluorescence complementation，BiFC)確定了OsSPX4與OsPHR2互作的主要亞細(xì)胞部位是在細(xì)胞質(zhì)中，但細(xì)胞核中也有互作信號(hào)。將35S-OsPHR2-mCherry和35S-OsSPX4-GFP融合基因共轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)同對(duì)照（35S-OsPHR2-mCherry和35S-GFP共轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體）相比，OsPHR2-mCherry的主要熒光信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)中，而對(duì)照組的OsPHR2

7、-mCherry信號(hào)主要在細(xì)胞核中。表明OsSPX4對(duì)OsPHR2進(jìn)入核內(nèi)具有阻礙作用。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因材料OsPHR2p-OsPHR2-FLAG、OsPHR2p-OsPHR2-FLA G/spx4和OsPHR2p-OsPHR2-FLAG/OxSPX4，表明在spx4突變體的條件下，OsPHR2-FLAG蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中的蛋白豐度都高于野生型，但在細(xì)胞核中具有極顯著的提高。在OxSPX4過表達(dá)的材料中，同野生型相比細(xì)胞質(zhì)中蛋白的豐

8、度沒有顯著變化，但細(xì)胞核中的OsPHR2-FLAG蛋白的豐度顯著降低。結(jié)果進(jìn)一步證明了細(xì)胞水平的結(jié)果，即OsSPX4影響OsPHR2在細(xì)胞核中的亞細(xì)胞定位。
　　綜上所述，OsSPX4與OsPHR2在細(xì)胞質(zhì)與核內(nèi)互作，進(jìn)而負(fù)調(diào)控OsPHR2功能。OsSPX4在蛋白水平響應(yīng)缺磷信號(hào)。在細(xì)胞缺磷狀況下OsSPX4蛋白通過蛋白降解途徑降解，從而增強(qiáng)OsPHR2進(jìn)核并與其順勢(shì)作用元件P1BS結(jié)合，啟動(dòng)其下游基因響應(yīng)缺磷信號(hào)及提高磷的吸收能