水稻磷信號(hào)和磷平衡中心調(diào)控因子的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、AtPHR1/OsPHR2是植物缺磷脅迫響應(yīng)中心調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，參與大部分缺磷響應(yīng)基因誘導(dǎo)表達(dá)。遺傳學(xué)上已表明水稻只包含SPX結(jié)構(gòu)域的SPX1是PHR2的抑制子，但SPX蛋白如何負(fù)調(diào)控PHR2功能的機(jī)制尚不清楚。
　　 水稻有六個(gè)只包含SPX結(jié)構(gòu)域基因。其中SPX1和SPX2細(xì)胞核特異定位。我們研究發(fā)現(xiàn)SPX1和SPX2的表達(dá)水平缺磷誘導(dǎo)受PHR2直接調(diào)控，提示SPX1和SPX2蛋白參與負(fù)反饋調(diào)控PHR2功能。
　　 突變

2、體材料水培生理實(shí)驗(yàn)顯示，充分供磷（200μM Pi）條件下spx1、spx2和spx1/spx2突變體植株磷濃度顯著高于野生型。spx1/spx2雙突變體由于嚴(yán)重磷積累造成老葉葉尖出現(xiàn)壞死早衰和植株生長(zhǎng)抑制。33P吸收實(shí)驗(yàn)表明，spx1、spx2和spx1/spx2突變體磷吸收能力和磷從根往地上部轉(zhuǎn)運(yùn)能力增加。對(duì)突變體材料里PHR2下游缺磷響應(yīng)基因表達(dá)分析表明，IPS1、miR399、miR827、PT2、SQD2和PAP1基因在spx

3、1/spx2雙突材料里都顯著誘導(dǎo)表達(dá)，但spx1單突變體誘導(dǎo)表達(dá)IPS1、miR399和PT2，而spx2單突變體只誘導(dǎo)表達(dá)PT2。缺磷不同時(shí)間點(diǎn)磷信號(hào)分析表明，spx1、spx2和spx1/spx2突變體材料對(duì)缺磷信號(hào)超敏。我們分析SPX1與SPX2超表達(dá)材料發(fā)現(xiàn)SPX1和SPX2超表達(dá)延緩PHR2下游缺磷響應(yīng)基因誘導(dǎo)表達(dá)。SPX1和SPX2相關(guān)突變體和超表達(dá)材料分析結(jié)果顯示，SPX1和SPX2負(fù)反饋調(diào)控PHR2功能，且存在部分功能冗

4、余。
　　 通過(guò)原位雜交和SPX1-GUS/SPX2-GUS融合蛋白組織化學(xué)分析表明，SPX1和SPX2都在葉片的葉肉細(xì)胞和維管束及側(cè)根除表皮外的其它組織表達(dá)。但是它們?cè)谥鞲磉_(dá)部位有所區(qū)別:SPX1主要在主根表皮、外皮層、厚壁組織和中柱表達(dá)，皮層有微弱表達(dá);SPX2主要在主根外皮層和厚壁組織表達(dá)。SPX1和SPX2相似組織表達(dá)部位與其具有功能冗余一致。SPX1和SPX2截短蛋白亞細(xì)胞定位分析表明，SPX結(jié)構(gòu)域決定SPX1和SP

5、X2的細(xì)胞核特異定位，暗示SPX1和SPX2行使功能需要SPX結(jié)構(gòu)域。
　　 已報(bào)道SPX結(jié)構(gòu)域都是通過(guò)蛋白互作發(fā)揮作用。蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，在供磷和缺磷條件SPX1和SPX2都通過(guò)SPX結(jié)構(gòu)域與PHR2蛋白互作。PHR2截短蛋白分析顯示，SPX1和SPX2與PHR2蛋白負(fù)責(zé)結(jié)合P1BS元件的C端互作。雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)不僅確認(rèn)蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而且表明SPX1、SPX2及其SPX結(jié)構(gòu)域與PHR2或PHR2的C端截短蛋

6、白在細(xì)胞核里形成蛋白復(fù)合體。煙草雙熒光瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示，超表達(dá)SPX1、SPX2或包含完整SPX結(jié)構(gòu)域的N端蛋白區(qū)段（SPX1-N195和SPX2-N191）能顯著抑制PHR2轉(zhuǎn)錄4×P1BS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LUC（firefly luciferase）報(bào)告基因表達(dá)。進(jìn)一步體內(nèi)染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，SPX1和SPX2通過(guò)蛋白互作抑制PHR2結(jié)合P1BS，且SPX結(jié)構(gòu)域完全可以行使抑制功能。體內(nèi)染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也表明SPX1和SPX2

7、抑制PHR2結(jié)合下游不同基因啟動(dòng)子能力存在差異。
　　 分析SPX1和SPX2與PHR2相關(guān)遺傳材料磷濃度和磷信號(hào)表明，SPX1、SPX2或SPX結(jié)構(gòu)域（SPX1-N195和SPX2-N191）超表達(dá)可以回復(fù)PHR2超表達(dá)引起的磷積累和缺磷響應(yīng)基因誘導(dǎo)表達(dá)。反之，phr2突變體可以回復(fù)spx1和spx2突變?cè)斐傻牧追e累和缺磷響應(yīng)基因誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果證明SPX1和SPX2與PHR2遺傳互作，同時(shí)也在遺傳學(xué)上證明SPX1和SPX2行使

8、負(fù)調(diào)控PHR2功能依賴一段包含完整SPX結(jié)構(gòu)域的N端蛋白區(qū)段。pt2突變體回復(fù)spx1和spx2突變體磷濃度升高表型，表明spx1和spx2磷濃度升高主要依賴PHR2介導(dǎo)的PT2誘導(dǎo)表達(dá)。這與已報(bào)導(dǎo)的pt2突變可以回復(fù)PHR2超表達(dá)引起地上部磷積累的結(jié)果一致。
　　 綜上所述，本研究揭示SPX結(jié)構(gòu)域蛋白負(fù)反饋調(diào)控水稻磷信號(hào)和磷平衡中心轉(zhuǎn)錄因子PHR2功能機(jī)制，而且含完整SPX結(jié)構(gòu)域的N端蛋白區(qū)段足夠發(fā)揮SPX1/2全長(zhǎng)蛋白功能。