飼料有效磷評(píng)價(jià)與磷營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)素材

1、Techniques of Feedstuffs Phosphorus Bioavailability and Phosphorus Nutritional Regulation,方 熱 軍 教授/博導(dǎo)Fang Re-jun Prof.Email: fangrj63@126.com,飼料有效磷評(píng)價(jià)與磷營養(yǎng)調(diào)控技術(shù),報(bào)告提綱　Outline,研究背景,飼料有效磷評(píng)價(jià),磷的吸收與營養(yǎng)調(diào)控,在生產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值,一、研究背景,1、

2、磷的生理功能及其影響,,10萬噸/年,磷酸氫鈣,,低估飼料磷利用率0.1個(gè)百分點(diǎn),則增加439噸磷酸氫鈣添加量,,,磷排泄增加，加重環(huán)境污染,養(yǎng)豬成本增加,,,,Pi,exorbitant dietary Pi,,,Pi added will be excreted with feces,,polluted environment,7,2、飼料有效磷評(píng)價(jià)技術(shù),動(dòng)物消化（代謝）試驗(yàn) 體外透析法 外翻腸囊法 放射性32P技術(shù),8,動(dòng)

3、物消化試驗(yàn),,體內(nèi)消化試驗(yàn),相對(duì)效價(jià)法（斜率比法）,,絕對(duì)效價(jià)法,,表觀消化率,真消化率,,,,,,,,,有機(jī)磷,無機(jī)磷,②植酸磷必須被水解為無機(jī)磷被吸收,①少量作為含磷有機(jī)物的組成被直接吸收,①簡單擴(kuò)散,②Na+依賴型磷轉(zhuǎn)運(yùn),,,,3、磷的吸收及其機(jī)理,10,細(xì)胞膜液體鑲嵌模型,膜的共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是: 以液態(tài)的脂質(zhì)雙分子層為基架，其中鑲嵌著具有不同分子結(jié)構(gòu)和生理功能的蛋白質(zhì)分子。細(xì)胞膜內(nèi)還含有少量糖類。,,無機(jī)磷主動(dòng)吸收的

4、生物學(xué)特性,,,,運(yùn)輸動(dòng)力,,,載 體,,來自無機(jī)磷電化學(xué)濃度梯度Na+-K+-ATP酶維持濃度梯度 反芻動(dòng)物中H+可代替Na+,Na/Pi-I Na/Pi-II：IIb是腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一調(diào)控Na-Pi跨腸道細(xì)胞頂膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Na/Pi-III,,,Na+先與載體結(jié)合，使其構(gòu)型改變，與Pi的親和力增強(qiáng)，Pi結(jié)合到載體上，二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，同時(shí)Pi被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi),12,該蛋白在逆濃度梯度將Pi由（?。┠c腔轉(zhuǎn)運(yùn)到

5、細(xì)胞內(nèi)時(shí)，必須先與Na+結(jié)合； Na+泵的活動(dòng)形成貯備勢能是其它物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能量來源。,Na+-k+-ATPase,Na+/Pi-IIb載體蛋白,二、飼料有效磷評(píng)價(jià),設(shè)2個(gè)4×4拉丁方,試驗(yàn)一、生長豬試驗(yàn),設(shè)2個(gè)6×6拉丁方和3個(gè)4×4拉丁方,測定內(nèi)源磷排泄量,測定常用飼料磷的消化率,,,（方熱軍等，2004，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)；2006， 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)； Fang et al.,2007,

6、 Livestock Science; Fang et al., 2007, Asian-Austrinial Journal of Animal Science ）,REG法和差量法測定的豆粕和次粉日糧磷真消化率和內(nèi)源磷排泄量比較,植物性飼料磷消化率（%）,（專利申請(qǐng)?zhí)枺?#160;200510018773.3 ）,恒溫水浴培養(yǎng)75分鐘 加入1ml胰蛋白酶溶液（2.405mg/ml+1MNaCO3）,Pala

7、film膠密封,試驗(yàn)二、體外透析法評(píng)定飼料有效磷含量,（方熱軍等，2004；鄒秀蕓，2008）,植物性飼料原料磷體外透析率（鄒秀蕓，2008）,a本試驗(yàn)體外透析法測定b參考方熱軍（2003）測定數(shù)據(jù),透析率（％）,試驗(yàn)三、外翻腸囊法評(píng)定飼料有效磷含量,（鄒秀蕓，2008；徐運(yùn)杰，2009；專利申請(qǐng)?zhí)枺?00810143162.5 ）,,研究了影響腸囊培養(yǎng)的因素,,研究結(jié)果表明：生長肉雞小腸離體培養(yǎng)適宜條件是：時(shí)間約為40～50 min

8、、溫度為36℃～38℃、pH范圍是6.0～7.0； 用外翻腸囊法評(píng)定飼料磷吸收速率時(shí)，培養(yǎng)液中磷含量不要超過200μg/ml； 用外翻腸囊法評(píng)定飼料磷生物學(xué)效價(jià)時(shí)，培養(yǎng)液中磷含量以50μg/ml左右為宜。,采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每種飼料一個(gè)處理，共5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)腸囊。,加酶,無酶,38℃，pH6.5，80r/min，50min,,植物性飼料磷的生物學(xué)效價(jià)（%）,飼料

9、有效磷不同評(píng)價(jià)方法結(jié)果比較,三、磷的吸收與 營養(yǎng)調(diào)控,日糧不同磷水平及維生素D對(duì)磷吸收調(diào)控的機(jī)理研究,,,,,,,日糧低磷，Na-Pi吸收比例增加；Na-Pi轉(zhuǎn)運(yùn)速度提高,飼糧磷水平,鈣含量及鈣磷比,飼糧中的鈣含量升高則磷的相對(duì)生物學(xué)利用率降低,pH值,影響腸道磷轉(zhuǎn)運(yùn)速度，存在動(dòng)物種間差別,,影響因素,維生素D,VD[1,25-(OH)2-D3]促進(jìn)磷的吸收,,,影響磷吸收的因素,我們主要研究了這兩方面因素對(duì)肉雞、大鼠不同部

10、位磷吸收代謝的影響,,,飼糧不同磷水平對(duì)肉雞腸道磷代謝及Na/Pi-IIb轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白mRNA表達(dá)的影響,Experiment 1,試驗(yàn)研究,（賀佳等. 2010；畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)）,試驗(yàn)設(shè)計(jì),0.4%Pi,0.4%Pi,0.6%Pi,0.8%Pi,1.0%Pi,,,,,A,B,C,D,60日齡體重約1.5Kg的三黃肉雞40只，隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只雞。,測定方法,,,,,,,,DNase I消化,小腸總RNA的提取及完

11、整性檢測,RNA反轉(zhuǎn)錄,實(shí)時(shí)定量PCR(Real-Time PCR),- 采用Trizol為裂解液，按步驟提取- 跑1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,- 使用DNase I對(duì)總RNA消化，以去除基因組痕量DNA污染,- 參照Invitrogen M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用方法進(jìn)行cDNA第一鏈合成 - PCR擴(kuò)增管家基因檢測反轉(zhuǎn)錄是否成功,- 儀器使用ABI PRISM 7900HT,,,在普通PCR儀上對(duì)β-actin和Na

12、/Pi-IIb的部分片段進(jìn)行擴(kuò)增 退火溫度范圍55～62℃；引物和cDNA模板用量為0.5～1.5μL,,,,引物設(shè)計(jì),反應(yīng)條件優(yōu)化摸索,β-actin：sense5’-CAGCCATCTTTCTTGGGTAT-3’antisense5’-GTTTAGAAGCATTTGCGGTG-3’ Na/Pi-IIb：sense5’-GAAAGTGGTGAAGATGCC-3’antisense5’-AAGTATGAGACCGATGG

13、C-3’,最終反應(yīng)采用57℃退火溫度，引物和模板用量均為1μL 。各樣品引物擴(kuò)增的Ct值由各自的擴(kuò)增曲線分別得出，根據(jù)公式：2-△△Ct=2- (Ct目的基因—Ct管家基因) ，計(jì)算出樣品中Na/Pi-IIb mRNA與β-actin相對(duì)表達(dá)豐度。,研究結(jié)果：反應(yīng)條件,總RNA 1%瓊脂糖電泳圖,PCR條件優(yōu)化效果圖,β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.107*LOG(X)+21.149，Eff.=100.98%，Slope:-3.1

14、068，R2=0.988,Na/Pi-IIb標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.325*LOG(X)+32.521，Eff.=98.82%，Slope:-3.325，R2=0.981,Na/Pi-IIb溶解曲線,β-actin溶解曲線,飼糧不同磷水平對(duì)肉雞腸道Na/Pi-IIb mRNA表達(dá)的影響,（以對(duì)照組B的肉雞空腸前段組織為對(duì)照樣品，即對(duì)照樣品2-△△Ct值為1）,,,,,Proximal jejunum,Distal jejunum,0.4

15、%,0.6%,0.8%,1.0%,十二指腸,空腸前段,空腸后段,回 腸,21.87±2.26A,15.39±3.87A,13.59±1.10a,21.41±2.55A,16.05±2.87b,12.34±1.33Aa,12.05±1.97ab,15.85±2.24a,14.58±2.25ab,12.01±0.79ab,10.48

16、7;125a,15.05±2.24a,12.78±0.76a,11.55±1.54b,9.86±0.69a,15.34±1.54a,不同磷水平條件下各腸段對(duì)飼料磷的體外吸收率,提示：四組日糧磷體外吸收率均表現(xiàn)為從十二指腸到空腸后段逐漸下降然后在回腸段升高的趨勢。,較低磷（0.4%）時(shí)磷體外吸收率顯著高于其他磷水平（P<0.05）,飼糧磷水平調(diào)控Na/Pi-IIb mRNA基因表達(dá)

17、。在飼糧磷水平較低時(shí)，Na/Pi-IIb mRNA表達(dá)量隨飼糧磷水平升高而增加；當(dāng)飼糧磷水平升高到一定程度時(shí)，則抑制Na/Pi-IIb mRNA表達(dá)。,本試驗(yàn)中TP 0.4%為三黃肉雞育肥期適宜的日糧磷添加水平。,小結(jié),39,,飼料磷體外吸收率與其表觀消化率相關(guān)性低（P>0.05）；飼料磷體外吸收率與其真消化率呈極顯著相關(guān)性（P<0.01）。,磷在空腸段的吸收主要以Na/Pi-IIb磷轉(zhuǎn)運(yùn)的主動(dòng)運(yùn)輸為主，而在回腸中則以自

18、由擴(kuò)散占優(yōu)勢,磷的絕對(duì)吸收量隨日糧磷水平的提高而增加，但吸收效率降低。,不同日糧磷水平下，1,25-(OH)2D3對(duì)大鼠磷吸收的調(diào)控作用,Experiments 2,試驗(yàn)研究,（曹滿湖，方熱軍等. 2010，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)；動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)）,試驗(yàn)設(shè)計(jì),探討了VD正常或缺乏，或缺乏后補(bǔ)充情況下，不同磷水平Na＋/Pi-Ⅱb mRNA的表達(dá)和磷的吸收變化。,正常VD3組,,缺乏VD3組,研究結(jié)果,Tendency of bone Ca

19、to dietary phosphate under varied situation of VD,骨鈣隨著磷水平的增加呈上升趨勢，但缺乏VD組補(bǔ)充VD后血鈣濃度增長最快，不同磷水平中以0.6%磷組濃度上升最高；但正常VD下，以低磷組骨鈣濃度為最高。骨磷變化趨勢與骨鈣相同。,C:對(duì)照組；L：VD缺乏組；I：補(bǔ)充VD組,Content of Pi in blood to dietary phosphate under varied

20、 situation of VD,血液中鈣、磷變化趨勢與骨骼鈣、磷相同，皆以正常磷或高磷組為最高，缺乏VD的動(dòng)物補(bǔ)充VD3后，骨骼和血液中鈣磷含量都增長的比正常VD組高。,C:對(duì)照組；L：VD缺乏組；I：補(bǔ)充VD組,,,Tendency of Na＋/Pi-Ⅱb mRNA expression to dietary phosphate under varied situation of vitamin D3,C:對(duì)照組；L：VD缺

21、乏組；I：補(bǔ)充VD組,,VD3缺乏時(shí)，NaPi-Ⅱb基因?qū)Φ土椎姆磻?yīng)比正常磷水平組要強(qiáng)；即補(bǔ)給VD3時(shí)，低磷組該基因表達(dá)量比正常磷水平組高；但小腸和腎臟對(duì)低磷的反應(yīng)是相反的，即腎臟中Na＋/Pi-Ⅱb mRNA表達(dá)量隨著磷水平的增加而增高。,Effects of dietary phosphate to Pi intake of BBMV under varied situation of vitamin D3,,,C:對(duì)照組

22、；L：VD缺乏組；I：補(bǔ)充VD組,VD3缺乏時(shí)，正常磷水平的磷吸收比低磷組高，但補(bǔ)充VD3后，低磷組對(duì)磷的吸收提高比正常磷組高,可見，隨著磷水平的增加，補(bǔ)充VD3對(duì)磷吸收的提高效應(yīng)逐步降低。 表明：低磷情況下，VD3是磷吸收的重要調(diào)節(jié)因素。,① 低磷提高了回腸和空腸中Na＋/PiⅡb載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)量和磷的吸收，本研究中，大白鼠適宜的低磷水平為0.2%。,② 大白鼠Na＋/PiⅡb載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)量以回腸

23、最高，腎臟最低；磷的吸收也以回腸最高，其次為空腸、腎臟、十二 指腸。,③ VD3是調(diào)節(jié)動(dòng)物低磷適應(yīng)性和磷吸收的重要因素。,小 結(jié),四、在生產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值,在生產(chǎn)中應(yīng)用價(jià)值,提供了可參考的飼料有效磷含量飼料有效磷的預(yù)測模型低磷日糧配制技術(shù),,1、體外法預(yù)測體內(nèi)法結(jié)果,真可消化磷（g/kg，Y）預(yù)測模型,2、預(yù)測有效磷含量模型,Y=-0.220+0.589**X1-0.304X2+0.003X3,R2=0.882　 RSD=0.24

24、4　 p<0.001,Y=-0.0629 +0.655*X1-0.412*X2 R2=0.859　RSD=0.386　 p<0.001　　　　?。╪=21）,*X1＝總磷（g/kg） X2＝植酸磷（g/kg） X3＝植酸酶活（FTU/kg）,可透析磷預(yù)測模型　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（n=21）,Y=-0.725**+0.566**X1-0.35**X2+0.0044**X3 R2=0.918,

25、 RSD=0.207,*X1＝總磷（g/kg） X2＝植酸磷（g/kg） X3＝植酸酶活（FTU/kg）,不同飼料類型真可消化磷（g/kg，Y）預(yù)測模型,*X1＝總磷（g/kg） X2＝植酸磷（g/kg） X3＝植酸酶活（FTU/kg）,專利：1、一種豬飼料及制備方法（CN200510018773.3） 2、 一種飼料有效磷測定方法（200810143162.5）,成果：1、豬氮磷營養(yǎng)調(diào)控及環(huán)境安全技術(shù)研究

26、與應(yīng)用， 獲2006年湖南省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)?。ǚ綗彳姡?） 2、畜禽氮磷代謝調(diào)控及其安全型飼料配制關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用 獲2008年國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)?。ǚ綗彳?，6）。,低磷日糧配制技術(shù),,,,致 謝,1、磷在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與飼料有效磷評(píng)定方法研究； （湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才項(xiàng)目，2005-2008）2、飼料有效磷評(píng)定新方法的研究； （國家留學(xué)基金委留學(xué)回國