水稻PHR1家族基因?qū)α仔盘?hào)和磷平衡綜合調(diào)控的研究.pdf

1、磷素(Phosphorus，P)是植物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也必不可少。外部環(huán)境磷養(yǎng)分供應(yīng)不足會(huì)嚴(yán)重影響作物生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致減產(chǎn)。雖然土壤中磷含量很高，但土壤中磷的不易移動(dòng)性和低效性使得磷成為植物生長(zhǎng)的限制因素，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不得不大量施用磷肥，這不但增加了生產(chǎn)成本，還造成了環(huán)境污染。因此培育磷高效的農(nóng)作物才是保持農(nóng)業(yè)可續(xù)發(fā)展的重要途徑。
　　PHR1(Phosphate Starvation Response1)在植物磷

2、信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中作為中心調(diào)控因子，通過結(jié)合P1BS基序(PHR1 binding site，P1BS)調(diào)控植物磷信號(hào)與磷平衡。PHR1在不同物種中如何調(diào)控磷信號(hào)與平衡已有大量研究，但水稻中PHR1家族多基因在磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中如何協(xié)同調(diào)控仍不清楚。因此本論文旨在深入探討水稻PHR1家族基因?qū)α仔盘?hào)和磷平衡的協(xié)同調(diào)控機(jī)制。
　　通過同源比對(duì)分析，本研究在水稻中分析了PHR1的同源基因OsPHR3，其屬于MYB-CC家族，位于水稻第2號(hào)染色體

3、(2079149-2075496)，cDNA全長(zhǎng)1404bp，編碼468個(gè)氨基酸，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成。同時(shí)，本研究購(gòu)買獲得了OsPHR3的Tos-17插入突變體(NE3009_0_102_1A)，命名為phr3。
　　利用qRT-PCR和GUS組織切片技術(shù)，本研究分析了水稻中三個(gè)磷信號(hào)調(diào)控因子OsPHR1，OsPHR2與OsPHR3(簡(jiǎn)寫為PHR1-3)在不同時(shí)期的組織表達(dá)特性。qRT-PCR分析表明PHR1-3在水稻整

4、個(gè)生長(zhǎng)期均表達(dá);葉中OsPHR1和OsPHR2在不同時(shí)期的表達(dá)差異并不顯著;OsPHR3的表達(dá)在抽穗期顯著誘導(dǎo)。GUS葉片橫切表明OsPHR1主要位于維管組織，OsPHR3主要位于維管組織與葉肉細(xì)胞，而OsPHR2的表達(dá)部位覆蓋了OsPHR1和OsPHR3的所有表達(dá)部位。
　　由GUS組織切片可知，PHR1-3可能存在功能冗余。因此，為了進(jìn)一步分析PHR1-3的功能，本研究發(fā)展了PHR1-3的相關(guān)突變體;單突:phr1、phr2、

5、phr3;雙突:phr1/2、phr1/3和phr2/3三突:phr1/2/3。 qRT-PCR分析結(jié)果可知，phr1、phr2與 phr3突變后對(duì)OsPHR2下游磷饑餓響應(yīng)基因OsIPS1、OsPT和OsmiR827都有不同程度抑制。正常供磷(200μM Pi)條件下，phr2、phr1/2、phr2/3及phr1/2/3生長(zhǎng)受到不同程度抑制;phr1、phr2、phr3的有效磷含量與野生型相比無顯著差異，而phr1/2/3的有效磷含

6、量顯著降低。缺磷(0μM Pi)條件下，突變體phr1、phr2、phr3、phr1/2、phr1/3、phr2/3和phr1/2/3的根毛伸長(zhǎng)與野生型相比受到抑制。這些結(jié)果說明PHR1-3三個(gè)基因存在功能冗余及加性。通過對(duì)PHR1-3相關(guān)突變體進(jìn)行基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，在phr1突變體中，有78基因被誘導(dǎo)，158個(gè)基因受到抑制;在phr3突變體中，有169個(gè)基因被誘導(dǎo)，155個(gè)基因受到抑制。但在三突phr12/3中，有2115個(gè)基因被誘導(dǎo)

7、，2224個(gè)基因受到抑制。而且，在phr1與phr3突變體中，均受到誘導(dǎo)的基因只有33個(gè)，受到抑制的有32個(gè);由此說明:OsPHR1，OsPHR2與OsPHR3在下游基因調(diào)控方面存在顯著的不同。
　　另外，本研究通過PHR1-3的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系分析了其對(duì)水稻磷信號(hào)與磷平衡的影響。正常供磷(200μM Pi)條件下OsPHR3的增強(qiáng)表達(dá)能引起地上部有效磷增加，有效磷含量高于OsHR1-Ov1，但低于OsPHR2-Ov-1。而在低磷

8、(10μM Pi)培養(yǎng)時(shí)葉片有效磷含量與野生型無顯著差異，說明OsPHR3參與水稻的磷饑餓響應(yīng)及磷平衡。正常供磷條件下，OsPHR1、OsPHR2及OsPHR3的增強(qiáng)表達(dá)能夠誘導(dǎo)缺磷信號(hào)，促進(jìn)根毛的伸長(zhǎng);其中OsPHR2根毛的誘導(dǎo)程度比OsPHR1和OsPHR3顯著，這一結(jié)果表明三個(gè)PHR蛋白的轉(zhuǎn)錄能力存在差異。溶液培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在正常磷(200μM Pi)或低磷(10μM Pi)條件下，OsPHR3過表達(dá)并不會(huì)影響水稻的生長(zhǎng)，田間實(shí)驗(yàn)分析

9、結(jié)果可知，在三個(gè)磷梯度實(shí)驗(yàn)中OsPHR3過表達(dá)株系的生物量及產(chǎn)量均比野生型要高，暗示OsPHR3對(duì)于培育耐低磷水稻新品種可能是一個(gè)重要候選基因。為此，本研究利用OsPHR3對(duì)長(zhǎng)江中下游的高產(chǎn)品種秀水134(XS134)進(jìn)行了遺傳改良，結(jié)果同樣表明OsPHR3改良株系具有耐低磷的特性。
　　為了分析OsPHR3過表達(dá)株系耐低磷的分子機(jī)制，本研究分析了PHR1-3對(duì)PHR1識(shí)別元件的親和力差異。利用酵母單雜(Yeast-one-hyb

10、ridization)和凝膠阻滯分析(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)三個(gè)PHR對(duì)不同P1BS的親和力存在差異，其中OsPHR2對(duì)P1BS親和力最高，OsPHR1次之，OsPHR3最弱。PHR1-3的親和力競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)同樣說明OsPHR3對(duì)識(shí)別基序P1BS的親和力是最弱的。
　　綜上所述，本研究揭示了三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子OsPHR1、OsPHR2、OsPHR3對(duì)水稻磷信號(hào)和磷平衡的