水稻Pht1家族磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的時(shí)空表達(dá)特征研究.pdf

1、磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，盡管在土壤中含量很高，但是它在土壤中的有效性卻非常低，使其成為植物生長(zhǎng)的一個(gè)限制性因子。植物需要通過(guò)表達(dá)多種不同親和的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)土壤中的有效磷。水稻種植面積廣，全世界有一半的人口都以稻米為食.盡管水稻中屬于Pht1家族的全部13個(gè)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的序列已經(jīng)被揭示，但是對(duì)它們的研究有限，除了明確其中的兩個(gè)基因，OsPhtl；11(OsPT11)和OsPhtl；13(OsPT13分別

2、受菌根強(qiáng)烈誘導(dǎo)和增強(qiáng)表達(dá)，其他Phtl基因的表達(dá)特征和功能還不了解。鑒于在過(guò)去發(fā)表的文章中已經(jīng)將該家族的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白簡(jiǎn)單定義為OsPT，為了便于比較和簡(jiǎn)單化，本文中所有Phtl家族全部13個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白仍然采用OsPTs命名，按序列編號(hào).為了研究OsPTs基因家族的時(shí)空表達(dá)模式和對(duì)磷素的響應(yīng)機(jī)制，本研究構(gòu)建了從模式品種日本晴(Oryza Sativa ssp. JapoIuca cv. Nipponbare)中12個(gè)Phtl基因的各個(gè)自身

3、的啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因和GFP報(bào)告基因相連接的基因，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到水稻(日本晴).通過(guò)分析這些轉(zhuǎn)基因水稻在缺磷和正常供磷情況下GUS(β-Glucuronidase)和GFP(Green Fluorescent Protein)報(bào)告基因的表達(dá)確定OsPhtls家族各個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)特征。通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件和不同植物中Phtl家族基因的同源性和表達(dá)特征的異同分析，進(jìn)一步分析推測(cè)了水稻中各個(gè)Phtl家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在磷素吸

4、收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面的功能。所獲主要結(jié)果如下： 1.通過(guò)軟件WOLFPSORT(http://wolfpsort.org/)分析亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)OsPTs基因家族的所有基因都定位于細(xì)胞膜上.分析36個(gè)來(lái)自不同植物的Phtl家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，13個(gè)OsPTs基因進(jìn)化關(guān)系非常接近，并且可以具體分為3個(gè)功能組.基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)，13個(gè)OsPTs基因分別分布在水稻12條染色體中的第1，3，4，6，8和10號(hào)染色體上，啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，W-

5、box，PHO-like element和PIBS三個(gè)可能參與缺磷誘導(dǎo)表達(dá)基因的啟動(dòng)子中的基序在水稻13個(gè)OsPTs基因家族中分別有出現(xiàn)，而且在不同基因啟動(dòng)子中還有多個(gè)拷貝. 2.RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)液栽培的缺磷處理?xiàng)l件下，OsPT1，OsPT2，OsPT3，OsPT4，OsPT5，OsPT6，OsPT7，OsPT8和OsPT12在根部都檢測(cè)到了基因表達(dá)，其中OsPT2，OsPT3，OsPT6和OsPT7缺磷條件下在根部

6、增強(qiáng)表達(dá)；OsPT1，OsPT2，OsPT3，OsPT5，OsPT6，OsPT7，OsPT8和OsPT12在葉片中有基因表達(dá)，其中OsPT1，OsPT3，OsPT6，OsPT7和OsPT12缺磷條件下在葉片中增強(qiáng)表達(dá)。在我們的研究條件下，OsPT9，OsPT10，OsPT11和OsPT13沒(méi)有檢測(cè)到基因表達(dá)信號(hào)。 3.通過(guò)分析其內(nèi)源啟動(dòng)子與GUS/GFP報(bào)告基因連接的轉(zhuǎn)基因水稻植株中GUS/GFP的時(shí)空表達(dá)狀況，按照GUS/GF

7、P的表達(dá)的部位和強(qiáng)度與活性確定相應(yīng)基因水稻中的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)OsPT1在缺磷條件下，根尖、支根發(fā)生區(qū)、根莖結(jié)合部、葉片均有強(qiáng)烈表達(dá)；在正常供磷情況下，OsPT1的表達(dá)略有減弱，但表達(dá)部位沒(méi)有發(fā)生明顯改變。在OsPT1花藥、灌漿期種子和發(fā)芽種子中都檢測(cè)到了該基因的表達(dá)。OsPT2基因受缺磷強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，在缺磷三周后，水稻的根尖、支根發(fā)生區(qū)和根莖結(jié)合部都有OsPT2的強(qiáng)烈表達(dá)，且集中在根尖、支根發(fā)生區(qū)和根莖結(jié)合部的中柱部位，但在表皮和皮層細(xì)

8、胞沒(méi)有表達(dá)。在灌漿期種子和發(fā)芽種子中也有OsPT2的表達(dá)。OsPT3在缺磷條件下，根尖、支根發(fā)生區(qū)都有基因表達(dá)，而且在根部缺磷條件下基因表達(dá)比供磷條件有明顯增強(qiáng)。在灌漿期種子和發(fā)芽種子中也有OsPT3基因的表達(dá)。OsPT4在缺磷和供磷條件下根尖和支根發(fā)生區(qū)都有微弱的表達(dá)。但OsPT4在葉片、灌漿期種子和發(fā)芽種子沒(méi)有表達(dá)。OsPT5在缺磷三周后，根尖、支根發(fā)生區(qū)、根莖結(jié)合部和葉片均有很微弱的表達(dá)，但是在供磷條件下其表達(dá)消失；在花藥、灌漿期

9、種子和發(fā)芽種子均沒(méi)有OsPT5基因的表達(dá)。OsPT6是受缺磷強(qiáng)烈特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因，缺磷三周后，在根尖、支根發(fā)生區(qū)、根莖結(jié)合部、葉片、花藥的中線部和發(fā)芽種子中都檢測(cè)到OsPT6基因的強(qiáng)烈表達(dá)。在灌漿期種子沒(méi)有檢測(cè)到OsPT6基因表達(dá)。OsPT7在缺磷處理下，支根發(fā)生區(qū)和葉片表達(dá)強(qiáng)烈，但根尖沒(méi)有檢測(cè)到該基因的表達(dá)，而在供磷條件下，基本檢測(cè)不到OsPT7基因在葉片中的表達(dá)。在花藥中檢測(cè)到了OsPT7的表達(dá)。OsPT8無(wú)論在缺磷或者供磷條件下

10、，除了根冠外的根系和葉片各部位都能檢測(cè)到強(qiáng)烈的表達(dá)，用其啟動(dòng)子與GFP連接基因的轉(zhuǎn)水稻植株中的GFP表達(dá)分析同樣重復(fù)了GUS報(bào)告基因表達(dá)的結(jié)果。與RT-PCR分析結(jié)果一致，OsPT9、OsPT10，OsPT11和OsPT13四個(gè)基因在本溶液栽培試驗(yàn)研究條件下，缺磷和正常供磷處理三周后的水稻植株中均沒(méi)有檢測(cè)到它們的表達(dá). 4.根據(jù)順勢(shì)作用元件(cis-elements)分析結(jié)果，結(jié)合RT-PCR和轉(zhuǎn)基因水稻檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)W-box

11、和P1BS兩個(gè)基序協(xié)同調(diào)控水稻缺磷條件下的基因表達(dá)，而PHO-like element可能對(duì)磷信號(hào)途徑中磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)調(diào)控作用有限。 5.推測(cè)OsPT1，OsPT2，OsPT3，OsPT5，OsPT6和OsPT7六個(gè)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在水稻缺磷條件下對(duì)磷素的吸收有重要作用；OsPT1，OsPT2，OsPT6，OsPT7和OsPT8五個(gè)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與水稻缺磷奈件下磷素的再轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)；OsPT1，OsPT2，OsPT3，OsPT4，