轉(zhuǎn)錄因子Fur直接調(diào)控鴨疫里氏桿菌毒力的研究.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的家鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種細菌性傳染病，臨床剖檢癥狀主要為全身漿膜的炎性滲出。本病在世界廣泛分布，感染引起高發(fā)病率和死亡率，為我國法定的二類動物疫病。RA血清型眾多且復雜，各血清型之間交叉保護性低，給該病的防治帶來諸多困難。而且本病一旦發(fā)生很難徹底清除，主要以藥物防治為主。因此加強RA的致病機制的研究，對從根本上預防該病的發(fā)生具有重要意義。

2、
　　鐵是細菌生長和繁殖的關鍵性元素，廣泛存在于細菌代謝途徑中。但是過量的鐵容易引起芬頓反應產(chǎn)生羥自由基進而對細胞產(chǎn)生毒害反應。鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白(ferric uptake regulator，F(xiàn)ur)不僅調(diào)控細菌鐵的穩(wěn)態(tài)，并且能夠與其它調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同作用，直接或間接調(diào)控細菌的生長、代謝和毒力。但是Fur在RA中的作用尚不清楚?；蛉笔羌毦肿由飳W研究的基本工具，但目前還沒有關于RA無抗性基因缺失株方法的報道。因此，本研究首先利用

3、苯丙氨酸-tRNA合成酶pheS和lacZ，構(gòu)建了RA-YM株fur基因無抗性缺失突變株。以野生型質(zhì)粒pRA-JX為基礎，構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc，利用該質(zhì)粒構(gòu)建回復株C△fur。通過動物實驗驗證Fur與RA的毒力有關。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術，篩選了鴨疫里氏桿菌基因組中受鐵調(diào)控基因和受Fur調(diào)控基因，對Fur調(diào)節(jié)RA的毒力機制進行研究。具體內(nèi)容如下:
　　1.鴨疫里氏桿菌fur基因無抗性基因缺失突變株△fur及回復株C△f

4、ur的構(gòu)建與鑒定
　　本文首先構(gòu)建了用于RA無抗性基因缺失突變株的自殺性質(zhì)粒pRE-lacZ-mpheS-spc和回復株的穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc。利用生長抑制試驗發(fā)現(xiàn)RA對0.2％對氯苯丙氨酸敏感，證實pheS可以做為負篩選標記。通過對PheS301位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楦拾彼幔渌M行無義突變，野生型核苷酸序列與突變型核苷酸序列同源性71％，減少在該位點發(fā)生同源重組的概率。將突變型pheS與RA的rpsL基因啟動子融合構(gòu)

5、建mpheS表達盒?？寺acZ基因，與rpsL啟動子融合，利用X-gal通過顏色可以直觀的鑒定同源重組是否完成。以pRE112質(zhì)粒為基礎，結(jié)合抗性基因spc，負篩選標記pheS和指示標記lacZ連接構(gòu)建自殺性質(zhì)粒pRE-lacZ-mpheS-spc。克隆pRA-JX質(zhì)粒的復制區(qū)域，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc，利用該質(zhì)?？梢詷?gòu)建穩(wěn)定遺傳的回復突變菌株。
　　構(gòu)建了RA-YM△fur無抗性基因缺失突變株和回復株C△fur。克

6、隆fur基因的左、右同源臂，利用重疊PCR將左右同源臂融合，通過酶切的方法并連接至自殺性質(zhì)粒pRE-lacZ-mpheS-spc。以含有自殺性質(zhì)粒pRE-lacZ-mpheS-spc-fur的E.coli X7213為供體菌，以RA-YM株為受體菌，通過兩步同源重組法篩選得到RA-YM△fur無抗性基因缺失突變株。第一步首先利用篩選標記spc篩選雜合體菌株，第二步利用篩選標記pheS和lacZ篩選無抗性基因缺失株。克隆fur基因啟動子和

7、編碼區(qū)序列，利用重疊PCR融合fur基因啟動子和編碼區(qū)，通過酶切的方法連接到穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc。以含有重組穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc-fur的E.coli X7213為供體菌，以RA-YM△fur為受體菌，利用篩選標記spc篩選回復株C△fur。
　　通過感染雛鴨測定RA-YM△fur的致病性。動物試驗結(jié)果顯示野生株RA-YM、基因缺失突變株RA-YM△fur和回復突株C△fur的LD50分別為2.0×106CFU

8、，1.6×108CFU和1.2×107CFU。RA-YM△fur基因缺失突變株的毒力較野生株RA-YM毒力下降約80倍，回復株C△fur的毒力較RA-YM△fur毒力有所回升。對野生株RA-YM和RA-YM△fur基因缺失突變株的血液和組織載菌量進行比較，結(jié)果顯示RA-YM△fur基因缺失突變株的載菌量均較野生株RA-YM低。另外組織剖檢和病理切片觀察，RA-YM△fur基因缺失突變株引起的組織病變較野生株RA-YM輕微。證實fur基因

9、與RA-YM株的毒力有關。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子Fur的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的研究
　　通過對RA-YM菌株和RA-YM△fur菌株在限鐵和富鐵情況下的轉(zhuǎn)錄組進行比較，從全基因組水平上篩選受鐵調(diào)控基因和受Fur調(diào)控基因。并隨機挑選4個受鐵調(diào)控的基因和4個受Fur調(diào)控的基因，利用熒光定量PCR對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行驗證，結(jié)果顯示熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相符。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選出70個受鐵調(diào)控基因和17個受Fur調(diào)控基因。轉(zhuǎn)錄組測序

10、具體結(jié)果如下:
　　限鐵條件下，鐵調(diào)控的基因中有45個基因表達上調(diào)。其中7個與細菌的鐵運輸和儲存有關，6個與細菌的固氮過程有關，5個與氨基酸和輔酶的合成有關，5個與細胞表面結(jié)構(gòu)與修飾有關，2個與嘌呤和核苷酸的合成有關;其余的與大分子的合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能以及未知功能等有關。限鐵條件下，鐵調(diào)控的基因中有25個基因表達下調(diào)。其中6個與三羧酸循環(huán)有關，7個與氧化應激有關，其余與細胞的轉(zhuǎn)運功能以及未知功能等有關。
　　Fur直接調(diào)控的

11、基因有17個，其中5個參與鐵的獲取，2個參與氧化應激，1個為Ⅸ型分泌系統(tǒng)元件，其余參與氨基酸的合成和未知功能等。另外對Fur直接調(diào)控的基因啟動子序列分析，預測得到Fur結(jié)合位點的序列為5'-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3'。
　　利用pET28a-fur質(zhì)粒對Fur蛋白進行原核表達。擴增fur基因的編碼區(qū)，通過酶切構(gòu)建pET28a-fur質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.coil BL21(DE3)感受態(tài)細胞。利用IPTG誘導表達并利用

12、His標簽純化柱純化Fur蛋白。隨機選擇4個受Fur調(diào)控的基因，利用生物素標記的引物擴增其啟動子序列，利用原核表達的Fur蛋白，通過凝膠遷移實驗驗證Fur蛋白與啟動子的互作，結(jié)果顯示Fur蛋白在體外可以與調(diào)控基因的啟動子序列結(jié)合。
　　綜上所述，本試驗成功的構(gòu)建了基于苯丙氨酸-tRNA合成酶pheS和lacZ為篩選標記的無抗性基因缺失株方法，構(gòu)建了fur基因缺失株RA-YM△fur。構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc，利用該質(zhì)粒