轉(zhuǎn)錄因子Fur直接調(diào)控鴨疫里氏桿菌毒力的研究.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的家鴨、鵝、火雞和多種禽類(lèi)的一種細(xì)菌性傳染病，臨床剖檢癥狀主要為全身漿膜的炎性滲出。本病在世界廣泛分布，感染引起高發(fā)病率和死亡率，為我國(guó)法定的二類(lèi)動(dòng)物疫病。RA血清型眾多且復(fù)雜，各血清型之間交叉保護(hù)性低，給該病的防治帶來(lái)諸多困難。而且本病一旦發(fā)生很難徹底清除，主要以藥物防治為主。因此加強(qiáng)RA的致病機(jī)制的研究，對(duì)從根本上預(yù)防該病的發(fā)生具有重要意義。

2、
　　鐵是細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的關(guān)鍵性元素，廣泛存在于細(xì)菌代謝途徑中。但是過(guò)量的鐵容易引起芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害反應(yīng)。鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白(ferric uptake regulator，F(xiàn)ur)不僅調(diào)控細(xì)菌鐵的穩(wěn)態(tài)，并且能夠與其它調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同作用，直接或間接調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)、代謝和毒力。但是Fur在RA中的作用尚不清楚。基因缺失是細(xì)菌分子生物學(xué)研究的基本工具，但目前還沒(méi)有關(guān)于RA無(wú)抗性基因缺失株方法的報(bào)道。因此，本研究首先利用

3、苯丙氨酸-tRNA合成酶pheS和lacZ，構(gòu)建了RA-YM株fur基因無(wú)抗性缺失突變株。以野生型質(zhì)粒pRA-JX為基礎(chǔ)，構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc，利用該質(zhì)粒構(gòu)建回復(fù)株C△fur。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Fur與RA的毒力有關(guān)。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，篩選了鴨疫里氏桿菌基因組中受鐵調(diào)控基因和受Fur調(diào)控基因，對(duì)Fur調(diào)節(jié)RA的毒力機(jī)制進(jìn)行研究。具體內(nèi)容如下:
　　1.鴨疫里氏桿菌fur基因無(wú)抗性基因缺失突變株△fur及回復(fù)株C△f

4、ur的構(gòu)建與鑒定
　　本文首先構(gòu)建了用于RA無(wú)抗性基因缺失突變株的自殺性質(zhì)粒pRE-lacZ-mpheS-spc和回復(fù)株的穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc。利用生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RA對(duì)0.2％對(duì)氯苯丙氨酸敏感，證實(shí)pheS可以做為負(fù)篩選標(biāo)記。通過(guò)對(duì)PheS301位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楦拾彼幔渌M(jìn)行無(wú)義突變，野生型核苷酸序列與突變型核苷酸序列同源性71％，減少在該位點(diǎn)發(fā)生同源重組的概率。將突變型pheS與RA的rpsL基因啟動(dòng)子融合構(gòu)

5、建mpheS表達(dá)盒。克隆lacZ基因，與rpsL啟動(dòng)子融合，利用X-gal通過(guò)顏色可以直觀的鑒定同源重組是否完成。以pRE112質(zhì)粒為基礎(chǔ)，結(jié)合抗性基因spc，負(fù)篩選標(biāo)記pheS和指示標(biāo)記lacZ連接構(gòu)建自殺性質(zhì)粒pRE-lacZ-mpheS-spc?？寺RA-JX質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)域，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc，利用該質(zhì)粒可以構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的回復(fù)突變菌株。
　　構(gòu)建了RA-YM△fur無(wú)抗性基因缺失突變株和回復(fù)株C△fur?？?/p>

6、隆fur基因的左、右同源臂，利用重疊PCR將左右同源臂融合，通過(guò)酶切的方法并連接至自殺性質(zhì)粒pRE-lacZ-mpheS-spc。以含有自殺性質(zhì)粒pRE-lacZ-mpheS-spc-fur的E.coli X7213為供體菌，以RA-YM株為受體菌，通過(guò)兩步同源重組法篩選得到RA-YM△fur無(wú)抗性基因缺失突變株。第一步首先利用篩選標(biāo)記spc篩選雜合體菌株，第二步利用篩選標(biāo)記pheS和lacZ篩選無(wú)抗性基因缺失株。克隆fur基因啟動(dòng)子和

7、編碼區(qū)序列，利用重疊PCR融合fur基因啟動(dòng)子和編碼區(qū)，通過(guò)酶切的方法連接到穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc。以含有重組穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc-fur的E.coli X7213為供體菌，以RA-YM△fur為受體菌，利用篩選標(biāo)記spc篩選回復(fù)株C△fur。
　　通過(guò)感染雛鴨測(cè)定RA-YM△fur的致病性。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示野生株RA-YM、基因缺失突變株RA-YM△fur和回復(fù)突株C△fur的LD50分別為2.0×106CFU

8、，1.6×108CFU和1.2×107CFU。RA-YM△fur基因缺失突變株的毒力較野生株RA-YM毒力下降約80倍，回復(fù)株C△fur的毒力較RA-YM△fur毒力有所回升。對(duì)野生株RA-YM和RA-YM△fur基因缺失突變株的血液和組織載菌量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示RA-YM△fur基因缺失突變株的載菌量均較野生株RA-YM低。另外組織剖檢和病理切片觀察，RA-YM△fur基因缺失突變株引起的組織病變較野生株RA-YM輕微。證實(shí)fur基因

9、與RA-YM株的毒力有關(guān)。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子Fur的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的研究
　　通過(guò)對(duì)RA-YM菌株和RA-YM△fur菌株在限鐵和富鐵情況下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，從全基因組水平上篩選受鐵調(diào)控基因和受Fur調(diào)控基因。并隨機(jī)挑選4個(gè)受鐵調(diào)控的基因和4個(gè)受Fur調(diào)控的基因，利用熒光定量PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相符。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果篩選出70個(gè)受鐵調(diào)控基因和17個(gè)受Fur調(diào)控基因。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

10、具體結(jié)果如下:
　　限鐵條件下，鐵調(diào)控的基因中有45個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。其中7個(gè)與細(xì)菌的鐵運(yùn)輸和儲(chǔ)存有關(guān)，6個(gè)與細(xì)菌的固氮過(guò)程有關(guān)，5個(gè)與氨基酸和輔酶的合成有關(guān)，5個(gè)與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)與修飾有關(guān)，2個(gè)與嘌呤和核苷酸的合成有關(guān);其余的與大分子的合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能以及未知功能等有關(guān)。限鐵條件下，鐵調(diào)控的基因中有25個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中6個(gè)與三羧酸循環(huán)有關(guān)，7個(gè)與氧化應(yīng)激有關(guān)，其余與細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及未知功能等有關(guān)。
　　Fur直接調(diào)控的

11、基因有17個(gè)，其中5個(gè)參與鐵的獲取，2個(gè)參與氧化應(yīng)激，1個(gè)為Ⅸ型分泌系統(tǒng)元件，其余參與氨基酸的合成和未知功能等。另外對(duì)Fur直接調(diào)控的基因啟動(dòng)子序列分析，預(yù)測(cè)得到Fur結(jié)合位點(diǎn)的序列為5'-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3'。
　　利用pET28a-fur質(zhì)粒對(duì)Fur蛋白進(jìn)行原核表達(dá)。擴(kuò)增fur基因的編碼區(qū)，通過(guò)酶切構(gòu)建pET28a-fur質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.coil BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并利用

12、His標(biāo)簽純化柱純化Fur蛋白。隨機(jī)選擇4個(gè)受Fur調(diào)控的基因，利用生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增其啟動(dòng)子序列，利用原核表達(dá)的Fur蛋白，通過(guò)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Fur蛋白與啟動(dòng)子的互作，結(jié)果顯示Fur蛋白在體外可以與調(diào)控基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合。
　　綜上所述，本試驗(yàn)成功的構(gòu)建了基于苯丙氨酸-tRNA合成酶pheS和lacZ為篩選標(biāo)記的無(wú)抗性基因缺失株方法，構(gòu)建了fur基因缺失株RA-YM△fur。構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pRES-JX-spc，利用該質(zhì)粒