鴨疫里氏桿菌免疫診斷方法及在感染鴨肝臟差異表達基因的研究.pdf

1、鴨疫里氏桿菌（Riemerella anantipestifer，RA）病是由鴨疫里氏桿菌引起的雛鴨的一種急性、接觸性敗血性傳染病，是嚴重危害我國養(yǎng)鴨業(yè)的重要傳染病之一。鴨疫里氏桿菌血清型復雜，各血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護，這給使用全菌滅活疫苗或弱毒疫苗進行該病的免疫防治帶來了諸多困難。臨床分離菌株的鑒定和血清定型及鴨群鴨疫里氏桿菌抗體的監(jiān)測，對了解鴨疫里氏桿菌的流行情況和制定有效的免疫計劃以及評價疫苗免疫效果具有重要意義。鴨疫里

2、氏桿菌在入侵宿主后，迅速在感染位點定居、繁殖，經(jīng)血液擴散到全身各組織器官，引起全身多發(fā)性漿膜炎并發(fā)展為敗血癥。而目前對鴨疫里氏桿菌如何在宿主體內生存、繁殖和逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視并致病的分子機制知之甚少。本研究針對我國流行的血清1型鴨疫里氏桿菌的42kD外膜蛋白OmpA進行了克隆、表達和免疫原性研究，探索外膜蛋白OmpA的免疫保護作用及其作為包被抗原建立用于鴨疫里氏桿菌分子流行病學調查的ELISA診斷方法；在此基礎上，利用選擇性捕獲轉錄序列技

3、術對鴨疫里氏桿菌在感染鴨肝臟基因差異表達進行了研究，為進一步開展了鴨疫里氏桿菌致病分子機理的研究，闡明雛鴨腹腔廣泛性漿液滲出的分子機制奠定基礎。本研究取得的結果如下：
　　 1．鴨疫里氏桿菌平板染色診斷抗原的制備和應用
　　 用本實驗室鑒定、保存的血清1型鴨疫里氏桿菌云夢分離株（RA-YM）制備了RA平板染色診斷抗原，該抗原與鴨流感、鴨瘟、鴨肝炎、鴨大腸桿菌和鴨沙門氏菌的等5種病原的陽性血清無交叉反應；染色抗原平板凝集試

4、驗與瓊脂免疫擴散試驗（AGID）對RA疫苗免疫鴨的抗體檢出率結果表明，在疫苗免疫后12天，平板凝集法即可檢測到RA抗體，檢出率為30％，AGID在免疫后31天才能檢測到抗體，檢出率為10％，而平板凝集法的檢出率為80％，平板凝集法抗體檢出率明顯高于AGID，且染色抗原平板凝集試驗比AGID的靈敏度高3個滴度；不同批次的平板染色診斷抗原檢測的陽性率基本相當，在凝集程度上有較小的差異，表明不同批次平板染色診斷抗原具有良好的重復性。以RA-Y

5、M和純化的鴨IgG為免疫原免疫鴨和兔，制備了鴨抗1型RA和兔抗鴨IgG的高免血清，平板凝集試驗檢測鴨抗RA-YM高免血清的效價為1：32，兔抗鴨IgG高免血清的瓊擴效價為1：64。以制備的鴨抗血清1型RA血清對分離自湖北省不同地區(qū)的23株鴨疫里氏桿菌進行血清型鑒定，結果均為血清1型，表明我省目前流行的RA主要是血清1型。將制備的兔抗鴨IgG高免血清純化后，經(jīng)辣根過氧化物酶（HRP）標記，制備出特異性強、免疫學活性高的兔抗鴨IgG-HRP

6、，工作濃度為1：4000，為下一步建立一種用于RA流行病調查的間接ELISA診斷方法奠定了基礎。
　　 2．鴨疫里氏桿菌OmpA基因的克隆、表達及重組OmpA蛋白免疫保護性試驗研究
　　 根據(jù)RA15型CVL110/89株OmpA基因序列（GeneBank登錄號：AF104936）合成特異性引物，PCR擴增了RA-YM株OmpA基因，克隆到pMD18-T，獲得重組質粒pT-OmpA并進行了測序；將OmpA克隆到pGEX-

7、KG，構建了重組原核表達質粒pGEX-OmpA，轉化E．coli BL21后經(jīng)IPTG誘導獲得高效表達，經(jīng)SDS-PAGE分析，表達的重組蛋白的分子量為68kD，表達產物主要以包涵體形式存在，Western-blot證實表達產物具有良好的生物學活性。將重組表達的OmpA蛋白以0.5mg、1.0mg、1.5mg三個免疫劑量分別與弗氏完全佐劑乳化后免疫7日齡櫻桃谷肉鴨，17日齡以同樣劑量加強免疫，二免后8天攻毒（3×106CFU/只），在攻

8、毒24h后蛋白免疫組和未免疫空白組均發(fā)病，動物試驗結果表明重組表達的OmpA不能起到保護作用。
　　 3．鴨疫里氏桿菌間接OmpA-ELISA檢測方法的建立及初步應用
　　 用大腸桿菌表達的重組蛋白OmpA建立了RA抗體OmpA-ELISA檢測方法，方陣滴定確定了抗原最佳包被濃度為0.81μg/mL，血清最佳稀釋倍數(shù)為1：160。通過檢測84份鴨疫里氏桿菌病陰性血清，確定該方法的陰陽性臨界值為0.22。用該方法檢測鴨流感

9、，鴨瘟，鴨肝炎，鴨大腸桿菌和鴨沙門氏菌的標準陽性血清OD450值均小于臨界值0.22，表明該方法與其它病原抗體無交叉反應，特異性強。重復性試驗表明OmpA-ELISA檢測方法的批內重復和批間重復的變異系數(shù)均小于10％。用建立的OmpA-ELISA檢測方法和平板凝集分別對213份送檢血清進行檢測，結果表明OmpA-ELISA檢測方法的敏感性為95.77％，二者的符合率為62.91％。將湖北漢川、荊州和武漢市江夏區(qū)、黃陂區(qū)等地送檢的472份

10、鴨血清采用建立的OmpA-ELISA檢測方法進行檢測，結果表明RA抗體陽性率為64.6％，說明建立的間接OmpA-ELISA檢測方法能夠很好的應用于臨床RA抗體檢測。
　　 4．應用選擇性捕獲轉錄序列技術（SCOTS）篩選鴨疫里氏桿菌在感染鴨肝臟中差異表達的基因的研究
　　 根據(jù)RA D-24105株16S rRNA基因序列（GeneBank登錄號：AY871819），合成特異性引物，PCR擴增了RA-YM株16S rR

11、NA基因，克隆到pMD18-T，獲得重組質粒pT-16SrDNA并進行測序，結果表明克隆的RA-YM株16S rRNA為1479bp，其GeneBank登錄號為FJ031240。比對分析Genbank中已公布的表皮葡萄球菌（GeneBank登錄號：NC002737），多殺巴氏桿菌（GeneBank登錄號：NC002663）、大腸桿菌（GeneBank登錄號：NC000913）和噬二氧化碳單胞菌（GeneBank登錄號：AY661855）

12、23S rRNA基因序列的保守區(qū)域，利用Primer premier5.0設計3對引物，分3段分別擴增了23S rRNA基因，克隆到pMD18-T，獲得重組質粒pT-23S2、pT-23S1和pT-23S3并進行測序，拼接結果表明克隆的RA-YM株23S rRNA為2655bp，其GeneBank登錄號為FJ031241。對生物素標記的RA-YM基因組DNA和構建好的RA-YM核糖體rDNA質粒（pT-16SrDNA，pT-23S-1r

13、DNA和pT-23S-3rDNA）超聲破碎，凝膠電泳結果表明破碎產物大小為100-2000bp。
　　 以血清1型RA-YM感染9日齡櫻桃谷肉鴨，提取感染鴨肝臟的總RNA和TSB培養(yǎng)基中生長的RA-YM的總RNA，經(jīng)SuperScriptTMⅢ RTase反轉錄，Klenow酶合成cDNA第二鏈后，記為體內感染cDNAs（in vivo cDNAs）和RA-YM體外培養(yǎng)cDNAs（in vitro cDNAs）。對in vivo

14、 cDNAs和in vitro cDNAs進行3輪SCOTS，得到均一化的RA-YM在體內感染時轉錄的cDNAs和在TSB培養(yǎng)時轉錄的cDNAs，通過3輪差異雜交選擇性捕獲RA-YM在感染鴨肝臟中差異表達的基因，將RA-YM在感染鴨肝臟中差異基因的PCR產物克隆到pMD18-T載體，轉化E．coli DH5 a感受態(tài)細胞，通過PCR和斑點雜交，從文庫中篩選出187個差異克隆，經(jīng)序列測定和比對分析獲得了48個RA-YM在感染鴨肝臟中差異表

15、達的基因。Real-time RT-PCR對甘氨酸裂解酶T亞基，尿黑酸1，2-加氧酶，天冬氨酸轉氨酶，觸酶，磷酸鹽轉運蛋白．，二肽肽酶Ⅳ，肽酶M28，和RA46等8個基因的差異表達情況進行驗證，結果表明與生長于TSB培養(yǎng)基RA的基因表達水平相比，這8個基因在RA感染過程中的表達水平上調1.44-4.62倍，t-檢驗分析表明8個基因的表達水平差異顯著。根據(jù)基因功能，將48個基因分為六類：合成與代謝，適應性調節(jié)，應激，轉運系統(tǒng)，蛋白酶和5個

16、未知功能序列。本研究初步揭示了RA在感染鴨肝臟的基因表達情況，獲得的差異表達基因對研究RA在宿主體內的存活、增殖及持續(xù)感染具有重要的作用。
　　 本研究篩選到二肽肽酶Ⅳ（Dipeptidyl peptidaseⅣ，DPPⅣ）可能是RA重要的毒力因子。DPP IV是一種絲氨酸蛋白酶，能特異性水解氨基端第二位是脯氨酸的多肽。牙齦卟啉單胞菌的DPPⅣ能夠降解結締組織以及介導牙齦卟啉單胞菌與纖粘蛋白的粘附，缺失dppⅣ基因的牙齦卟啉單胞

17、菌的毒力明顯降低。格氏鏈球菌的DPPⅣ可以酶解P物質，協(xié)同胞外精氨酸蛋白酶酶解緩激肽，導致血管通透性的變化及感染的內皮組織平滑肌的收縮。雛鴨感染鴨疫里氏桿菌后，主要病理變化是全身各組織器官的漿膜面出現(xiàn)廣泛性的纖維素性滲出，RA感染嚴重損傷了雛鴨的血管內皮系統(tǒng)，導致血管通透性的增高。因此，二肽肽酶Ⅳ可能是RA關鍵的毒力因子。
　　 下一步研究將克隆、表達和缺失RA的dppⅣ基因，以及利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選和鑒定與DPPⅣ互作的宿主