鴨疫里氏桿菌CH3的TbdR1缺失株構(gòu)建.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起鴨、鵝、火雞和其他禽類(lèi)的一種接觸性傳染病,最常見(jiàn)于鴨。鴨疫里氏桿菌病發(fā)病率高、死亡率高;即使耐受過(guò)病的鴨,也因此影響生長(zhǎng)速度,甚至形成僵鴨,給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前人們對(duì)RA的分子致病機(jī)制等還知之甚少。
　　RA的GSM15868株的全基因組解析表明其基因組中含有31個(gè)編碼TonB依賴(lài)受體的基因,且它們之間的同源性很低,提示它們可能

2、在RA和宿主的相互作用過(guò)程中起著重要的作用。前期的研究表明,TonB依賴(lài)受體TbdR1是血清1型、2型和10型間的一種交叉免疫原性抗原。探究TbdR1的生物學(xué)功能對(duì)了解RA的分子致病機(jī)制十分有意義。
　　本研究首先用基因克隆測(cè)序的方法分析了tbdR1基因在不同血清型RA中的分布和同源性,結(jié)果表明所有檢測(cè)的RA菌株菌均攜帶tbdR1,且其氨基酸同源性高達(dá)98.2％-100%。其高度保守性提示該蛋白可能具有重要的生物學(xué)功能。
　

3、　其次,采用接合轉(zhuǎn)移的方法將重組性自殺質(zhì)粒pDS132-LSR導(dǎo)入RACH3株中,通過(guò)同源重組以1119bp的壯觀霉素抗性基因替代tbdR1基因ORF中的2726bp片段,從而獲得TbdR1的基因缺失株CH3ΔtbdR1。進(jìn)一步將完整的TbdR1基因以及OmpA啟動(dòng)子克隆到E.coli-RA穿梭表達(dá)載體pRES上,并將其回復(fù)到CH3ΔtbdR1中,從而獲得此缺失突變株的互補(bǔ)菌株cCH3ΔtbdR1。
　　為了檢驗(yàn)TbdR1基因在鴨

4、疫里氏桿菌CH3株中,對(duì)于鐵離子的吸收中是否起著重要的作用,用二吡啶(DIP)螯合培養(yǎng)基中的鐵離子,比較了RA的野生CH3株、基因缺失株CH3ΔtbdR1和互補(bǔ)菌株cCH3ΔtbdR1在低鐵環(huán)境下的的生長(zhǎng)繁殖情況,并在上述的培養(yǎng)基中加入不同形式的鐵離子(FeCl3或Hemin),研究TbdR1對(duì)CH3株獲鐵的影響;利用結(jié)晶紫染色的方法比較三株細(xì)菌的生物被膜形成能力是否具有差異;利用三株細(xì)菌黏附侵入Vero細(xì)胞的方法,比較它們對(duì)Vero細(xì)

5、胞的黏附與侵入能力;用動(dòng)物攻毒試驗(yàn)比較三株細(xì)菌的LD50,血液、肝臟和腦組織中的細(xì)菌載量,比較它們對(duì)雛鴨的致病性等方面的差異。結(jié)果表明,野生株CH3株和缺失株CH3ΔtbdR1在含200μmol/L鐵離子螯合劑DIP的TSB中均不能生長(zhǎng)繁殖;在上述培養(yǎng)基中添加FeCl3后,野生株CH3和互補(bǔ)菌株能生長(zhǎng),而缺失株仍然不能,提示TbdR1在CH3株獲鐵過(guò)程起著重要的作用。進(jìn)一步的研究表明,TbdR1與CH3株獲取Hemin有關(guān)。tbdR1缺

6、失顯著降低了CH3株的生物被膜形成能力,以及對(duì)Vero細(xì)胞的黏附和侵入能力。
　　動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果顯示,缺失株CH3ΔtbdR1對(duì)鴨的LD50比野生毒株CH3高45倍。另外,缺失株CH3ΔtbdR1在接種雛鴨后24h鴨血液、肝臟以及腦組織中的細(xì)菌載量與野生株相比顯著下降(p<0.01)。
　　綜上所述,研究的結(jié)果表明,TbdR1在鴨疫里氏桿菌CH3株的獲鐵(如hemin)過(guò)程中起著重要的作用,而且與CH3株的致病性相關(guān)。因此,