鴨疫里默氏桿菌自然弱毒株的部分特性研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鴨傳染性漿膜是家鴨、火雞和多種其它鳥類的一種接觸傳染性疾病。該病呈世界范圍分布，幾乎己在所有的集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)的國(guó)家發(fā)現(xiàn)。該病的發(fā)病率和死亡率較高，己成為目前危害世界各國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)室在前期對(duì)我國(guó)鴨傳染性漿膜炎的病原流行病學(xué)進(jìn)行了研究，分離、鑒定、保存有500余株鴨疫里默氏桿菌。本文在此基礎(chǔ)上篩選出2株低致病力

2、的鴨疫里默氏桿菌，通過16SrDNA核苷酸序列測(cè)定及對(duì)雛鴨的半數(shù)致死量與毒力穩(wěn)定性測(cè)定，確證為鴨疫里默氏桿菌自然弱毒株，并對(duì)其侵襲性、培養(yǎng)濾液的細(xì)胞毒性、免疫原性、培養(yǎng)及生化特性等進(jìn)行研究，可為進(jìn)一步研究鴨疫里默氏桿菌毒力因子和弱毒菌苗等提供材料。本研究的主要結(jié)果如下： 1.以擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的通用引物(16S-8F/20)和(16S-1512R/21)為引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序顯示DY株和517株的

3、擴(kuò)增部分片段大小分別為1436bp和1440bp，BLAST軟件分析發(fā)現(xiàn)二者的核苷酸序列與已報(bào)道鴨疫里氏桿菌的同源性均達(dá)到99％以上，且相互之間的同源性為99％以上。 2.鴨疫里默氏桿菌自然弱毒517株和DY株對(duì)14日齡非免健康四川麻鴨的半數(shù)致死量分別為1.18×1010CFU和2.3x1010CFU：二者在lO-14日齡叵免健康鴨體內(nèi)連傳10代后的半數(shù)致死量分別為1.02x1010和2.2×1010CFU。 3.鴨疫里

4、默氏桿菌自然弱毒517株和DY株利用LB培養(yǎng)，去細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)超濾濃縮、硫酸銨沉淀、透析除鹽及微孔濾膜過濾除菌制備的培養(yǎng)濾液與鴨成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，在4小時(shí)內(nèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)與空自對(duì)照間差異不明顯，而陽(yáng)性對(duì)照AF株則呈現(xiàn)細(xì)胞膜消失、胞質(zhì)流失與核濃縮等；517株和DY株與鴨胚成纖維細(xì)胞共作用5h測(cè)得侵襲力分別為1320(CFU/ml)和1262(CFU/ml)，與強(qiáng)毒AF株1510(CFU/ml)間差異顯著(0.10

5、4.鴨疫里默氏桿菌自然弱毒517株和DY株滅活菌液與礦物油佐劑乳化制成滅活菌苗(5.5×109CFU/ml)免疫5日齡四川麻鴨，O.5ml/只，免疫后21天的血清抗體水平(ELISA)分別為1.618和1.884(A值)、同血清型強(qiáng)毒菌株攻毒保護(hù)率均為100％，28天的血清抗體水平分別為1.549和1.724、攻毒保護(hù)率均為100％；1.1×107CFU活菌接種后，試驗(yàn)鴨無明顯的臨床表現(xiàn)，21天的血清抗體水平分別為1.417和1.379

6、、攻毒保護(hù)率均為80％，28天的血清抗體水平分別為1.289和1.491、攻毒保護(hù)率分別為75％和100％。 5.鴨疫里默氏桿菌自然弱毒517株和DY株為具有莢膜的革蘭氏陰性小桿菌，在巧克力營(yíng)養(yǎng)平板上生長(zhǎng)旺盛，菌落為奶油狀，能在LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)；除517株發(fā)酵血清菊糖、阿拉伯糖和DY株發(fā)酵血清菊糖、阿拉伯糖、糊精外，不利用葡萄糖等其它碳水化合物；過氧化氫酶均呈陽(yáng)性；明膠液化試驗(yàn)均呈陰性；對(duì)青霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、痢特