鴨疫里默氏桿菌脂多糖隨機(jī)突變株的篩選及M949_1360基因生物學(xué)特性分析.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）為革蘭氏陰性小桿菌，可引起鴨、鵝、火雞等家禽和野禽的急性敗血性和滲出性炎癥，又稱(chēng)為鴨傳染性漿膜炎。本病在世界各地均有流行，可引發(fā)較高的發(fā)病率及死亡率，是當(dāng)前造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要細(xì)菌性傳染病之一。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分，參與識(shí)別宿主的免疫系統(tǒng)，并在對(duì)宿主的致病性方面起著重要作用。
　　本研究用

2、鴨疫里默氏桿菌血清1型CH3菌株作為免疫原，純化后的CH3 LPS作為包被抗原，依據(jù)間接ELISA的方法對(duì)細(xì)胞融合后的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，成功獲得一株CH3LPS的單克隆抗體并命名為1C1。通過(guò)抗體分型試劑盒測(cè)定LPS單克隆抗體1C1為Ig亞類(lèi)IgG3，腹水效價(jià)為1∶3200。本研究通過(guò)間接ELISA的方法，用單抗1C1作為一抗，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的1462株RA CH3轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變株進(jìn)行LPS突變株的篩選，成功篩選出一株對(duì)LPS單抗

3、1C1呈陰性反應(yīng)的突變株RA△604。Southern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)座子Tn4351在突變株RA△604基因組中為單次插入，轉(zhuǎn)座子插入的基因?yàn)镸9491360基因。BLAST分析結(jié)果表明，M9491360基因在鴨疫里默氏桿菌中高度保守，與DSM15868，RA-GD, ATCC11845=DSM15868, RA-CH-2,17,153, Yb2和RA-CH-1具有98％-100％的同源性。
　　對(duì)突變株RA△604的研

4、究發(fā)現(xiàn)，失活M949_1360基因后，其上、下游基因的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有顯著差異，表明RA△604 M949_1360基因的失活對(duì)其上、下游基因的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有極性效應(yīng)。對(duì)純化的LPS進(jìn)行銀染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生株CH3相比，突變株RA△604 LPS缺少了兩條分子量大約在21、15 kDa大小的條帶，表明突變株RA△604的LPS結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，預(yù)示著失活的M9491360基因與LPS合成相關(guān)。對(duì)構(gòu)建的回復(fù)株cRA604進(jìn)行全菌Westernblot，

5、發(fā)現(xiàn)單抗1C1反應(yīng)條帶在互補(bǔ)株得到回復(fù)，而在突變株RA△604為缺失，表明回復(fù)株cRA604的LPS表型有一定程度的回復(fù)。
　　依據(jù)體內(nèi)和體外兩個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)，對(duì)突變株RA△604進(jìn)行致病性及其致病機(jī)制的研究。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明突變株RA△604的半數(shù)致死量(LD50)大于1010 CFU，與野生株CH3的LD50(4.47×107 CFU)相比，減毒約200倍以上。體內(nèi)菌血計(jì)數(shù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變株RA△604在感染后5天內(nèi)血液中細(xì)菌菌量呈

6、現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，而野生株CH3在感染后前三天出現(xiàn)了明顯的血液載菌量增加的趨勢(shì)，之后隨時(shí)間推移血液的載菌量開(kāi)始下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變株RA△604在鴨體內(nèi)的生存能力明顯下降，對(duì)正常鴨血清的抵抗力試驗(yàn)結(jié)果表明缺失株的耐受力比野生株強(qiáng)，這可能是由于M949_1360基因的失活改變了細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)從而使突變株降低了補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷作用。對(duì)突變株RA△604粘附和入侵Vero細(xì)胞的能力進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的粘附和入侵能力都有顯著的下降?；貜?fù)株cRA6