應(yīng)用信號(hào)標(biāo)簽誘變技術(shù)篩選鴨疫里默氏桿菌的體內(nèi)存活相關(guān)基因.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌感染(Riemerella anatipestifer infection)又稱(chēng)為鴨傳染性漿膜炎，是家鴨、鵝、火雞及其他禽類(lèi)一種接觸性傳染病。本病是當(dāng)前危害全世界（尤其是中國(guó)）養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要疾病，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。其病原鴨疫里默氏桿菌是黃桿菌科里默氏桿菌屬的代表種，目前已確定的血清型至少有21個(gè)，且各血清型之間交叉保護(hù)性低或無(wú)，給本病的預(yù)防控制帶來(lái)較大困難。目前人們對(duì)鴨疫里默氏桿菌的分子致病機(jī)制還知之甚少。本研究通過(guò)

2、構(gòu)建血清1型鴨疫里默氏桿菌WJ4株攜帶不同標(biāo)簽轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)突變庫(kù)，以篩選和鑒定與鴨疫里默氏桿菌在鴨體內(nèi)存活相關(guān)的基因。
　　本研究分別構(gòu)建了鴨疫里默氏桿菌W J4株17個(gè)帶不同DNA標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫(kù)，共含有5100株突變株。先通過(guò)接種庫(kù)接種雛鴨后進(jìn)行負(fù)篩選，初篩得到不能從回收庫(kù)中檢測(cè)到的突變株63株，經(jīng)多次復(fù)篩最終篩查到了20株不能從回收庫(kù)檢測(cè)到的突變株。利用反向PCR的方法對(duì)這些突變株的轉(zhuǎn)座子插入基因組中的位置序列進(jìn)行了鑒

3、定，其中17株突變株已鑒定了轉(zhuǎn)座子插入的基因。
　　選取其中的兩株突變株7-295和16-284，將野生WJ4株的相應(yīng)基因擴(kuò)增并克隆到大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌穿梭表達(dá)載體pRES1上以構(gòu)建相應(yīng)的互補(bǔ)質(zhì)粒，然后通過(guò)接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將互補(bǔ)質(zhì)粒分別導(dǎo)入相應(yīng)的突變株中，獲得了兩株突變株的互補(bǔ)菌株c7-295和c16-284，最后比較野生WJ4株、突變株7-295、16-284和基因互補(bǔ)株c7-295、c16-284的生長(zhǎng)曲線和菌血載量等方面

4、的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，野生株、兩株突變株及其基因互補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線無(wú)顯著性差異;雛鴨接種細(xì)菌后24小時(shí)，突變株7-295和16-284接種鴨的血菌載量為0，而互補(bǔ)株c16-284接種鴨的血菌載量較突變株有一定的回復(fù);但回復(fù)株c7-295接種鴨的血菌載量并沒(méi)有回復(fù)。
　　本研究通過(guò)構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌WJ4株的信號(hào)標(biāo)簽轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)，篩選到了17個(gè)潛在的與WJ4株在鴨體內(nèi)存活相關(guān)的基因，并對(duì)其中兩個(gè)突變株的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。本研