鴨疫里默氏桿菌B739_1208基因的功能鑒定及其突變株的毒力評估.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）是一種革蘭氏陰性菌，是當(dāng)前影響世界養(yǎng)鴨業(yè)最常見的病原菌之一，可以感染1-8周齡的雛鴨、鵝、雞等多種家禽和鳥類，感染該菌主要引起以漿膜炎為主要特征的急性或慢性敗血癥，從而導(dǎo)致雛鴨大量死亡或生長緩慢，嚴重影響?zhàn)B鴨業(yè)的健康發(fā)展。鐵是幾乎所有的生命體包括細菌必需的一種營養(yǎng)元素，它是許多蛋白和酶的重要輔助因子，它參與了電子傳遞、核酸合成和氧化還原反應(yīng)等生命過程。致病菌為了達到感染宿

2、主的目的，進化產(chǎn)生了多種機制來獲得宿主體內(nèi)的鐵離子，由于這些鐵離子獲取機制與細菌的毒力息息相關(guān)，因而，可構(gòu)建鐵離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因敲除弱毒株作為一種潛在的弱毒疫苗來評價。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.鴨疫里默氏桿菌RA-CH-1株B739_1208基因缺失株的構(gòu)建
　　序列分析表明，鴨疫里默氏桿菌RA-CH-1 B739_1208基因可能與鐵離子利用相關(guān)，且其同源基因存在于所有的鴨疫里默式桿菌菌株中。為了研究該基因功能，需要構(gòu)

3、建該基因的缺失株。首先，設(shè)計引物，擴增B739_1208的左右兩側(cè)同源臂基因與壯觀霉素抗性基因盒片段，用酶切連接的方法將這三段連接在一起，再將該連接片段與自殺質(zhì)粒pEX18Gm連接，成功構(gòu)建了重組自殺載體;將重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入接合轉(zhuǎn)移供體菌E.coli S17-1，將該菌與RA-CH-1做接合轉(zhuǎn)移，以卡那霉素和壯觀霉素篩選陽性接合子，再通過多重PCR的方法對陽性克隆進行鑒定，成功構(gòu)建了缺失株B739_1208ΔB739_1208。生長曲

4、線測定結(jié)果可知，與野生株相比，B739_1208ΔB739_1208在TSB液體培養(yǎng)基中的生長速度明顯減慢。
　　2.鴨疫里默氏桿菌RA-CH-1 B739_1208基因功能的鑒定
　　在鐵離子限制性環(huán)境下比較RA-CH-1ΔB739_1208基因敲除株和親本株的生長情況，發(fā)現(xiàn)敲除株在低鐵條件下的生長情況受到了嚴重抑制，表明B739_1208基因與鐵離子的轉(zhuǎn)運相關(guān);但是，缺失株對于血紅素的利用能力卻增強，這可能是該基因的缺失

5、導(dǎo)致血紅素轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄增強所致。通過熒光定量PCR檢測RA-CH-1 B739_1208基因在富鐵環(huán)境及鐵離子限制環(huán)境的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示該基因的轉(zhuǎn)錄并不受環(huán)境中鐵離子的調(diào)控。
　　3.鴨疫里默氏桿菌RA-CH-1ΔB739_1208基因缺失株毒力的評估
　　比較以109 CFU的RA-CH-1野生株和RA-CH-1ΔB739_1208基因敲除株分別攻毒3日齡雛鴨后的死亡情況，得知突變株對雛鴨的致死率下降了約50％;隨

6、后，分別測定了兩種菌對于3日齡雛鴨的半數(shù)致死量，結(jié)果表明突變株的半數(shù)致死量上升了十幾倍，即其毒力下降了十幾倍;以109 CFU的RA-CH-1野生株和RA-CH-1ΔB739_1208基因敲除株混合感染3日齡雛鴨，研究兩種菌在雛鴨體內(nèi)的競爭情況，結(jié)果顯示，突變株在體內(nèi)的競爭力明顯減弱;最后，以109 CFU的兩種菌分別攻毒3日齡雛鴨，24 h和48 h后分離并計算其各個器官中細菌的載量，發(fā)現(xiàn)突變株的細菌載量遠低于野生株。綜上這些試驗，初