鴨疫里默氏桿菌轉(zhuǎn)座子隨即突變庫的構(gòu)建及毒力相關(guān)基因的篩選和鑒定.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎，是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)引起的、危害養(yǎng)鴨業(yè)的一種細菌性傳染病。目前已有4株RA的全基因組序列在GenBank上公布。RA基因組編碼基因約有2000個，但其中僅有少數(shù)基因功能已知。構(gòu)建大規(guī)模的隨機突變庫，是研究RA基因功能的一種重要手段。
　　本研究以鴨疫里默氏桿菌 Yb2株為受體菌、攜帶有質(zhì)粒 pEP4351的大腸桿菌BW19851為供體菌，

2、通過接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將質(zhì)粒pEP4351導(dǎo)入Yb2株中，然后轉(zhuǎn)座子Tn4351隨機插入Yb2株的基因組中；再利用Tn4351上的紅霉素抗性基因進行陽性接合子的篩選，構(gòu)建了一個包含約3100個突變株的隨機突變文庫。計算得轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為7.1×10-6。
　　通過接種雛鴨的感染實驗對突變株進行了篩選，初篩共獲得69株毒力減弱的突變株。利用反向PCR等技術(shù)對轉(zhuǎn)座子插入位點的序列進行了測定，獲得了27株突變株的轉(zhuǎn)座子插入位點。使用Souther

3、n blot對轉(zhuǎn)座子Tn4351插入突變株基因組的次數(shù)進行檢測，以確定突變株毒力減弱是由于單一的插入突變導(dǎo)致的。
　　在復(fù)核過的突變株中，選取了毒力減弱水平十分明顯突變株Y2666，根據(jù)轉(zhuǎn)座子插入失活的基因設(shè)計引物，將突變基因克隆到大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌穿梭表達載體pRES上，同樣通過接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將其導(dǎo)入突變株Y2666中，經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定得到了基因互補株cY2666。測定了野生株、突變株Y2666及互補株的生長曲線。為

4、了驗證Y2666突變基因?qū)A Yb2株的毒力是否有重要影響，通過動物實驗測定了野生株Yb2株、突變株Y2666和互補株cY2666的半數(shù)致死量，并測定了這三株菌在接種12h、24h時血液中的細菌載量。結(jié)果顯示，野生株Yb2株、隨機突變株Y2666和基因互補株cY2666的生長曲線結(jié)果接近，而對雛鴨的半數(shù)致死量存在顯著差異，隨機突變株Y2666的LD50值比野生株Yb2升高了209倍，而互補株cY2666的LD50比突變株降低了約3倍。