鴨疫里默氏桿菌免疫膠體金試劑盒的研制.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是鴨傳染性漿膜炎(Infectiousserositis)的病原體，主要感染家鴨、雞、火雞、鵝等家禽，該病的特征病變是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪樣輸卵管炎等，已成為目前危害禽類養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一，造成了巨大的經(jīng)濟損失。鴨疫里默氏桿菌血清型復(fù)雜，迄今為止，已公認的有21個血清型（1～21型），各血清型之間缺乏有效的交叉保護。臨床上通常以病例特征性

2、的癥狀和解剖的特征病變進行診斷，但是該病與禽致病性大腸桿菌病和禽沙門氏菌病在臨床癥狀和病理變化上很相似，很難進行鑒別診斷。病原菌的分離鑒定為該病的確診手段，但是其工作程序較為繁瑣，因此需要建立一種快速靈敏特異性強的方法以滿足臨床快速檢測診斷的需求。本實驗通過制備鴨疫里默氏桿菌免疫原性蛋白GroEL和TbdR的單克隆抗體，建立基于單克隆抗體的膠體金免疫檢測試劑盒，以滿足快速檢測的需要。
　　1、鴨疫里默氏桿菌GroEL、TbdR的原

3、核表達及蛋白純化
　　根據(jù)GenBank上發(fā)表的鴨疫里默氏桿菌groEL和tbdR的基因序列設(shè)計特異性引物，groEL基因（groEL1629bp）采用全長表達、tbdR基因采用全長和分段（tbdR-A2472bp，tbdR-B1020bp，tbdR-C1335bp，tbdR-D678bp）表達的方法，以鴨疫里默氏桿菌CH3菌株為模板進行PCR擴增?；蚱味ㄏ蚩寺”磉_載體pET-28a(+)和pET-30a(+)中，經(jīng)鑒定后成功

4、構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-groEL、pET30a-tbdR-A、pET30a-tbdR-B、pET30a-tbdR-C、pET30a-tbdR-D。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達宿主茵B(yǎng)L21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后pET28a-groEL、pET30a-tbdR-D重組蛋白獲得了表達，重組蛋白的分子量分別為60kDa和25kDa，而pET30a-tbdR-A、pET30a-tbdR-B、pET30a-tbdR-C未見表達。重組蛋白GroEL在

5、上清中表達，而TbdR在包涵體中表達，分別進行純化后，獲得了高純度和高活性的重組蛋白，為單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。
　　2、鴨疫里默氏桿菌GroEL、TbdR單克隆抗體的制備
　　純化的重組蛋白作為免疫原對BALB/c小鼠進行免疫，然后取免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，用間接ELISA篩選陽性細胞株并進行3次亞克隆后制備小鼠腹水單克隆抗體。共獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株4株，其中鴨疫里默氏桿菌Gr

6、oEL單抗兩株，分別命名為1G2B6和1G2F10;鴨疫里默氏桿菌TbdR單抗兩株，分別命名為1A12和3F1。腹水單克隆抗體ELISA效價均達到1∶102400。Western blot檢測結(jié)果表明四株單克隆抗體均能與鴨疫里默氏桿菌血清1、2和10型菌株發(fā)生特異性結(jié)合，而與禽致病性大腸桿菌、沙門氏菌和禽巴氏桿菌菌株無反應(yīng)性。本研究成功制備了穩(wěn)定性好、特異性強的鴨疫里默氏桿菌GroEL和TbdR單克隆抗體，為進一步研制基于抗體檢測鴨疫里

7、默氏桿菌抗原的試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
　　3、鴨疫里默氏桿菌免疫膠體金試劑盒的研制
　　用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，確定其最適標(biāo)記抗體的PH和抗體濃度。試驗選擇最佳的封閉液和硝酸纖維素膜，對純化的鴨疫里默氏桿菌GroEL和TbdR單克隆抗體進行抗體組合、濃度和反應(yīng)條件的篩選，以確定最佳的反應(yīng)體系。本實驗最終確定了金標(biāo)抗體是鴨疫里默氏桿菌GroEL單克隆抗體1G2F10(最適標(biāo)記pH為8.0，最適標(biāo)記濃度為3μg/mL)，N