鴨疫里氏桿菌2型可能的毒力基因片段的發(fā)現(xiàn)及該菌無(wú)致病力株的分離與鑒定.pdf

1、鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)感染是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病。除直接引起感染鴨出現(xiàn)急性或慢性敗血癥、纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎等發(fā)生死亡外，還可以引起干酪性輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎等。目前已發(fā)現(xiàn)21個(gè)血清型，各種血清型之間很少有交叉保護(hù)性。其中鴨疫里氏桿菌2型最為常見(jiàn)。國(guó)內(nèi)外雖然對(duì)RA有一些研究，但是在毒力因子、致病機(jī)理、保護(hù)性抗原等方面的研究尚未充分展開(kāi)。 從健康鴨咽部分離到一

2、株革蘭氏陰性短桿菌，定名為L(zhǎng)Y-58株。經(jīng)培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)檢查、生理生化試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定及PCR鑒定，分離株鑒定為鴨疫里氏桿菌2型。毒力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度的菌液腿部肌肉注射10d健康北京鴨，每組7羽(1mL/羽)，共5組。結(jié)果顯示，RA2型參考株RAF2株的LD<,50>為5.57×10<'7>CFU，而分離株LY-58以1.0×10<'10>CFU注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)一死亡，可確定為無(wú)致病性。 為尋找RA可能的毒力基因，本研究以鴨疫里

3、氏桿菌2型(RA2)毒力株RAF2及無(wú)毒力株LY-58為研究對(duì)象，應(yīng)用抑制性差減雜交技術(shù)，構(gòu)建了DNA差減文庫(kù)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，獲得600個(gè)克隆。隨機(jī)挑取96個(gè)白色克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，擴(kuò)增出100-1000bp大小的片段，并將其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果遞交GenBank進(jìn)行同源性查找，發(fā)現(xiàn)15個(gè)可能的新的毒力基因片段。該15個(gè)差異片段，即片段3<'＃>，49<'＃>，50<'＃>，62<'＃>，51<'＃>，57<'＃

4、>，41<'＃>，45<'＃>，56<'＃>，43<'＃>，6<'＃>，30<'＃>，52<'＃>，5<'＃>，39<'＃>，在GenBank上的登錄號(hào)分別是：DQ508421，DQ508422，DQ508423，DQ508424，DQ508425，DQ508426，DQ508427，DQ508428，DQ508429，DQ508430，DQ50843l，DQ508432，DQ508433，DQ508434，DQ508435。這在國(guó)內(nèi)外