煙曲霉中調(diào)控胞內(nèi)鐵離子平衡的毒力相關(guān)蛋白LeuB和MrsA的功能研究.pdf

1、近幾十年來，隨著免疫缺陷人群的不斷擴(kuò)大，侵襲性真菌感染呈逐年上升的趨勢。目前，引起廣泛關(guān)注的致病真菌主要有白念珠菌，隱球菌和煙曲霉，其中煙曲霉是導(dǎo)致侵襲性肺曲霉病的元兇。煙曲霉是一種腐生型的真菌，其分布廣，產(chǎn)孢強(qiáng)，在環(huán)境中無處不在。由于煙曲霉孢子直徑較小，其很容易被人體吸入肺中。對于正常的人體來說，吸入的孢子很容易被殺滅并清除。但是對于免疫缺陷的患者來說，煙曲霉經(jīng)呼吸道侵染后，體內(nèi)的免疫細(xì)胞若不能及時將其清除，這些逃脫免疫的孢子會在患者

2、體內(nèi)萌發(fā)、繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致侵襲性曲霉病。目前臨床上主要的抗真菌藥物有伊曲康唑，伏立康唑，兩性霉素B以及卡泊芬凈等。然而，這些藥物都有其局限性，其中兩性霉素對宿主的副作用較大;卡泊芬凈的抗菌譜窄;而運(yùn)用最廣泛的伊曲康唑和伏立康唑則很容易產(chǎn)生耐藥性。因此，開發(fā)抗菌活力強(qiáng)，抗菌范圍廣以及毒副作用小的新型抗真菌藥物成為了當(dāng)務(wù)之急，而重中之重是尋找合適的藥靶。
　　鐵離子作為一種重要的微量元素參與了一系列的生物學(xué)過程。由于宿主體內(nèi)的鐵多以血紅

3、蛋白以及乳鐵蛋白等形式存在，游離的鐵濃度很低，病原菌如何成功地從宿主體內(nèi)獲取鐵元素是其致病的關(guān)鍵。因此，病原菌中調(diào)控鐵離子吸收以及平衡的因子經(jīng)常也是毒力決定子，然而鐵離子平衡調(diào)控有關(guān)的機(jī)制在煙曲霉中仍知之甚少。
　　本研究論文以煙曲霉為研究材料，利用基因敲除等手段，對煙曲霉中與鐵離子代謝以及毒性都相關(guān)的功能基因leuB和mrsA開展了系統(tǒng)的研究，得到了以下結(jié)論:
　　1、證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子LeuB不僅調(diào)控?zé)熐沽涟彼岬暮铣?，同時也

4、調(diào)控鐵離子吸收。leuB的缺失會顯著降低與鐵載體合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(sidG，sit1和mirB)的轉(zhuǎn)錄以及低鐵載體的產(chǎn)生水平，從而影響煙曲霉在低鐵環(huán)境下生長。雙缺leuB和控制鐵離子吸收的轉(zhuǎn)錄因子hapX,會加劇ΔleuB對低鐵敏感的表型;而雙缺leuB和抑制鐵離子吸收的轉(zhuǎn)錄因子sreA，則會恢復(fù)ΔleuB對低鐵敏感的表型。這些結(jié)果均說明亮氨酸合成調(diào)控因子LeuB參與煙曲霉鐵離子吸收調(diào)控。
　　2、低鐵環(huán)境下，leuB的缺失會導(dǎo)

5、致細(xì)胞鐵離子吸收降低，leuA轉(zhuǎn)錄下調(diào)，進(jìn)而阻礙亮氨酸的合成。而亮氨酸合成的阻斷會使蛋白酶體活力增強(qiáng)從而導(dǎo)致蛋白全局性降解。進(jìn)一步研究證明LeuB的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Zn(Ⅱ)2Cys6)以及其C端對煙曲霉適應(yīng)低鐵環(huán)境以及維持蛋白穩(wěn)定等發(fā)面發(fā)揮著重要作用。
　　3、證實(shí)線粒體鐵通道m(xù)rsA的缺失會降低煙曲霉適應(yīng)低鐵以及高鐵環(huán)境的能力。同時，mrsA缺失也會導(dǎo)致sreA轉(zhuǎn)錄低調(diào)，而受SreA抑制的和鐵離子吸收相關(guān)的基因如sidA，m

6、irB，ftrA以及fetC則明顯高調(diào)。這些結(jié)果說明，MrsA是煙曲霉調(diào)控胞內(nèi)鐵離子平衡必需的。
　　4、進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)mrsA的缺失提高了煙曲霉對氧化應(yīng)激以及唑類藥物的敏感性，其原因主要是ΔmrsA中ROS積累所致。位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MrsA中第38，96以及214位保守的組氨酸位點(diǎn)是煙曲霉應(yīng)對高鐵，低鐵，氧化應(yīng)激以及唑類藥物等環(huán)境所必需的。
　　5、小鼠毒性實(shí)驗(yàn)證明煙曲霉中和鐵離子代謝相關(guān)的功能基因leuB以及mrsA都