金屬離子和離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在蠶絲成纖過(guò)程中的功能研究.pdf

1、早在五千多年前，中國(guó)古代勞動(dòng)人民就開(kāi)始栽桑養(yǎng)蠶，繅絲織綢。在古代中國(guó)，蠶絲已經(jīng)深入人民生活的各個(gè)角落，并被廣泛地用于服裝、藝術(shù)、印刷等領(lǐng)域，極大地豐富了當(dāng)時(shí)的社會(huì)生活。時(shí)至近現(xiàn)代，蠶絲仍然在為人類社會(huì)發(fā)展服務(wù)。除了傳統(tǒng)的紡織產(chǎn)業(yè)，目前蠶絲還應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、美容、光電、軍工、納米、環(huán)境保護(hù)等新興產(chǎn)業(yè)。
　　相較于蠶絲的應(yīng)用研究，關(guān)于蠶絲蛋白是如何在家蠶體內(nèi)成纖維的研究卻薄弱得多，蠶絲纖維化的具體機(jī)制仍然未被完全闡明。已有的研究結(jié)果表

2、明，蠶絲纖維化過(guò)程實(shí)質(zhì)上就是絲蛋白內(nèi)部構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，形態(tài)由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的過(guò)程。根據(jù)目前由體外實(shí)驗(yàn)獲得的一些證據(jù)，研究者提出這樣一種假說(shuō)：絲蛋白由家蠶絲腺分泌后以液態(tài)形式儲(chǔ)存，當(dāng)它流經(jīng)前部絲腺時(shí)，管徑突然變細(xì)，研究者推測(cè)管壁對(duì)于絲蛋白會(huì)產(chǎn)生剪切力，使得一部分絲蛋白分子開(kāi)始整齊排布；前部絲腺的酸性環(huán)境使得絲蛋白酸化脫水，一方面使絲蛋白濃縮，另一方面使絲素蛋白的N末端發(fā)生二聚化；前部絲腺還具有適宜的金屬離子強(qiáng)度，金屬離子可與絲蛋白中的某些氨

3、基酸殘基發(fā)生靜電相互作用；絲素蛋白二聚化以及絲素和金屬離子的相互作用進(jìn)一步將分子拉近并緊密排列，使絲蛋白形成液晶態(tài)結(jié)構(gòu)；當(dāng)絲蛋白進(jìn)入吐絲器后，吐絲器肌肉強(qiáng)大的壓縮伸展作用會(huì)提供更為強(qiáng)大的剪切力，將絲蛋白中多余的水分脫去；隨后，家蠶頭胸部的擺動(dòng)使得絲蛋白受到拉伸力的作用，分子沿著絲纖維的長(zhǎng)軸整齊緊密排列，從而形成固態(tài)的絲纖維。
　　根據(jù)以上假說(shuō)可以看出，家蠶的前部絲腺和吐絲器實(shí)際上就是絲蛋白纖維化的場(chǎng)所。要探究絲蛋白纖維化過(guò)程，對(duì)于

4、這兩個(gè)組織的研究必不可少。2013年本實(shí)驗(yàn)室對(duì)家蠶前部絲腺進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為本文的探討奠定了基礎(chǔ)。家蠶有幾個(gè)重要器官與蠶絲合成和分泌相關(guān)。其中，吐絲器較為微小，對(duì)其的研究還處于形態(tài)學(xué)觀察階段。而家蠶的菲氏腺是連接于吐絲器的微小腺體，功能不明。目前吐絲器、菲氏腺中基因、蛋白的表達(dá)情況以及其與絲蛋白纖維化的關(guān)系仍然未知。另外，由于模擬家蠶前部絲腺和吐絲器內(nèi)的生理生化環(huán)境十分困難，導(dǎo)致以上假說(shuō)均是由體外實(shí)驗(yàn)獲得的研究結(jié)果，體內(nèi)的真實(shí)情況

5、仍然未知。金屬離子是否能在體內(nèi)條件下與絲蛋白結(jié)合并通過(guò)與絲蛋白發(fā)生相互作用，來(lái)改變絲蛋白的構(gòu)象還不明確。
　　蠶絲蛋白質(zhì)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化會(huì)影響蠶絲纖維的力學(xué)性能。蠶絲纖維的形成過(guò)程即是蠶絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)改變的過(guò)程，也是賦予蠶絲纖維力學(xué)性能的過(guò)程。因此如果對(duì)蠶絲纖維形成過(guò)程的諸多要素，例如金屬離子濃度等，進(jìn)行調(diào)控，人為地改變蠶絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么就有可能對(duì)蠶絲纖維的力學(xué)性能進(jìn)行改造。這個(gè)思路是本文研究的重點(diǎn)之一。
　　鑒于此，

6、本研究采用分子生物學(xué)、化學(xué)、材料力學(xué)等多種技術(shù)手段，以金屬離子為切入點(diǎn)，對(duì)家蠶絲纖維形成過(guò)程進(jìn)行研究，并且利用轉(zhuǎn)基因的方法，人為地改變蠶絲纖維形成的離子環(huán)境，獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的、可生產(chǎn)高力學(xué)性能蠶絲的轉(zhuǎn)基因家蠶素材。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　1.家蠶吐絲器及菲氏腺的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　本研究首先對(duì)盛食期（五齡第3天）和吐絲期（上蔟第1天）的吐絲器和菲氏腺進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究。共在吐絲器中鑒定到11000多個(gè)基因。對(duì)

7、這些基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)它們很多涉及離子結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)、幾丁質(zhì)結(jié)合與代謝、表皮構(gòu)建等功能，極有可能參與了絲蛋白的纖維化。吐絲器中共鑒定到59個(gè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，其中7個(gè)負(fù)責(zé)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)，表達(dá)量最高的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶（BmSERCA）基因；吐絲器中鑒定到大量的氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，它們大多是空泡型氫離子ATP酶（V-ATPase）各個(gè)亞基的編碼基因；吐絲器中還有 Na+、K+、Zn2+、Cu2+和 PO43-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編

8、碼基因的表達(dá)，以上研究結(jié)果說(shuō)明了吐絲器與前部絲腺一樣具有活躍的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，能為絲纖維形成提供適宜的生理生化環(huán)境。
　　通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)及 GO富集分析，發(fā)現(xiàn)吐絲器與菲氏腺的差異基因均富集到了與小分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的功能上，說(shuō)明菲氏腺可能負(fù)責(zé)將一些小分子物質(zhì)（如水和離子）轉(zhuǎn)運(yùn)到絲腺腔中。通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、基因芯片數(shù)據(jù)及RT-PCR分析，本研究鑒定到一個(gè)菲氏腺特異表達(dá)的基因BGIBMGA013432。此基因注釋為假定轉(zhuǎn)運(yùn)體。
　　

9、2.家蠶吐絲器的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　在轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)上述兩個(gè)時(shí)期的吐絲器進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。分別在兩個(gè)時(shí)期鑒定到1355和1315個(gè)蛋白。對(duì)蛋白進(jìn)行分類后發(fā)現(xiàn)，吐絲器中與絲蛋白纖維化密切相關(guān)的蛋白（如表皮蛋白、離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、肌肉運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白和能量代謝蛋白）豐度較高。信號(hào)途徑分析發(fā)現(xiàn)吐絲器具有活躍的能量代謝、蛋白質(zhì)合成和降解過(guò)程。通過(guò)差異分析，總共在兩個(gè)時(shí)期篩選出差異蛋白232個(gè)，其中上調(diào)蛋白184個(gè)，下調(diào)蛋白48

10、個(gè)。這些差異蛋白主要參與了能量代謝、幾丁質(zhì)結(jié)合和表皮構(gòu)建過(guò)程。這說(shuō)明在吐絲器中，活躍的能量代謝過(guò)程為肌肉收縮，離子和水的轉(zhuǎn)運(yùn)提供豐富的能量，而幾丁質(zhì)結(jié)合和表皮構(gòu)建過(guò)程也為絲蛋白纖維化提供足夠的剪切力及自我保障。這進(jìn)一步證明了吐絲器能為絲纖維形成提供適宜的生理生化環(huán)境。
　　3.家蠶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶的功能研究
　　BmSERCA是在吐絲器中表達(dá)量最高的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，本部分首先對(duì)其進(jìn)行了信息分析，發(fā)現(xiàn)其高度保守。隨后克

11、隆了這個(gè)基因，對(duì)其胞內(nèi)段進(jìn)行原核表達(dá)、純化、制備多克隆抗體。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了具有生物學(xué)活性的重組SERCA蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞感染后48 h重組蛋白開(kāi)始表達(dá)，到96 h表達(dá)量最大，并且分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白還具有較高的酶活。對(duì)BmSERCA基因在絲腺中的表達(dá)模式進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，不管是轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平還是酶活水平，其都在前部絲腺表達(dá)量最高。為了研究 BmSERCA的功能，向上蔟期的家蠶血淋巴注射了SERCA的特異型抑制劑毒胡蘿卜

12、素（TG）。當(dāng)向家蠶注射2 nmol的TG后，發(fā)現(xiàn)家蠶繭殼中的鈣元素含量上升，說(shuō)明BmSERCA是調(diào)控絲腺和絲蛋白間Ca2+平衡的關(guān)鍵因子。通過(guò)FTIR分析，發(fā)現(xiàn)注射后的繭絲二級(jí)結(jié)構(gòu)含量也發(fā)生變化，螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增多，中間結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量降低，說(shuō)明BmSERCA參與了家蠶絲蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
　　4.金屬離子調(diào)控絲蛋白構(gòu)象及力學(xué)性能
　　前部絲腺和吐絲器是絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的場(chǎng)所。本研究調(diào)查了絲腺不同區(qū)段中金屬元素含

13、量及離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示鈉、鉀、鎂、銅和鋅元素含量由后到前逐漸升高，而鈣元素含量下降。通過(guò)qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)絲腺不同區(qū)段離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)量不同，其中前部絲腺和吐絲器中氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、鈉鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)水平很高。
　　利用向再生絲素中添加不同濃度的金屬離子和直接向家蠶注射金屬離子的方法分別在體外和體內(nèi)條件下研究了金屬離子對(duì)絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變及力學(xué)性能的影響。

14、圓二色光譜分析表明K+能劇烈地誘導(dǎo)再生絲素產(chǎn)生β折疊結(jié)構(gòu)，而Na+卻不能。Ca2+與Cu2+作用于絲素蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的情況類似，都只在特定濃度下誘導(dǎo)β折疊結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。通過(guò)注射的方法研究了金屬離子是否在體內(nèi)參與了絲蛋白的纖維化及金屬離子與絲纖維性能的關(guān)系。利用紅外光譜比較繭絲的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)注射K+及Cu2+后絲纖維的β折疊含量顯著增加，力學(xué)性能測(cè)試發(fā)現(xiàn)注射后繭絲較對(duì)照相比更強(qiáng)更硬。注射 Ca2+后繭絲的無(wú)規(guī)則卷曲、螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，而β轉(zhuǎn)角結(jié)

15、構(gòu)含量下降，繭絲的延展性和韌性提高。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，金屬離子可以在體內(nèi)調(diào)控絲蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，參與了絲蛋白的纖維化過(guò)程，并影響絲纖維的力學(xué)性能。
　　5.利用金屬離子對(duì)蠶絲纖維的力學(xué)性能進(jìn)行改良
　　在前面研究的基礎(chǔ)上，本部分通過(guò)基因操作技術(shù)對(duì)蠶絲蛋白纖維化的離子環(huán)境進(jìn)行了編輯，改變了蠶絲蛋白的構(gòu)象并獲得了力學(xué)性能穩(wěn)定提高的蠶絲纖維。利用紡絲管道特異啟動(dòng)子BmCP231分別將家蠶的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BmSERCA和鈉鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)

16、蛋白BmNKA進(jìn)行了過(guò)量表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因家蠶中，相應(yīng)基因和蛋白在前部絲腺得到過(guò)量表達(dá)的同時(shí)，轉(zhuǎn)基因家蠶各個(gè)組織及繭殼中的元素含量與對(duì)照相比具有顯著的差異。這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因家蠶體內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生了變化，但是并沒(méi)有對(duì)轉(zhuǎn)基因家蠶的經(jīng)濟(jì)性狀和繭與繭絲形態(tài)產(chǎn)生顯著影響。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因家蠶的繭絲，發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)BmSERCA的轉(zhuǎn)基因蠶絲β折疊和螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，相應(yīng)的強(qiáng)度，延展性和韌性都顯著增加，其中強(qiáng)度增加了21％、延展性增加了54%、韌性提高

17、了73%，而剛度與對(duì)照相比沒(méi)有太大差異。過(guò)量表達(dá)BmNKA的轉(zhuǎn)基因蠶絲無(wú)規(guī)則卷曲含量增加，β折疊結(jié)構(gòu)含量下降，最終導(dǎo)致其力學(xué)性能發(fā)生顯著下降。這一結(jié)果說(shuō)明改變家蠶絲纖維形成的離子環(huán)境可以調(diào)控絲纖維的力學(xué)性能，進(jìn)而對(duì)絲纖維性能的改良提供一個(gè)全新的視角。
　　綜上所述，本論文從全新的角度、系統(tǒng)的策略、多學(xué)科的技術(shù)手段，揭示了吐絲器和菲氏腺中基因（蛋白）表達(dá)情況，證明了金屬離子在體內(nèi)條件下參與了絲蛋白纖維化過(guò)程。通過(guò)對(duì)絲蛋白纖維化形成過(guò)