金屬銅離子與蛋白

1、金屬銅離子與蛋白質(zhì),,內(nèi)容：,研究的目的及意義銅與血清白蛋白銅與血紅蛋白銅蛋白和銅酶,研究目的及意義,在真核生物體內(nèi)，銅元素參與體內(nèi)的許多生化反應(yīng)，如作為電子傳遞鏈中的供體或受體；參與細(xì)胞內(nèi)的呼吸；維持鐵的代謝平衡；用于色素、神經(jīng)遞質(zhì)的合成；作為氧化還原酶參與體內(nèi)的抗氧化過程。但體內(nèi)銅離子濃度過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性，改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)；與某些氨基酸殘基的側(cè)鏈發(fā)生非特異反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊；與其它物質(zhì)競爭酶的活性中心，干擾酶

2、的正常功能；產(chǎn)生活性氧損害機(jī)體的DNA、蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì) 。所以，研究銅離子與生物分子的作用有重要意義。,銅與血清白蛋白,血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì),它可以與許多內(nèi)源性或外源性化合物結(jié)合,在生命體內(nèi)起著重要的儲(chǔ)存和輸運(yùn)作用。血清白蛋白是由肝臟合成的一種簡單蛋白質(zhì)，僅由氨基酸組成，沒有修飾基團(tuán)和其他附屬物。常以BSA( bovine serum albumin, 牛血清白蛋白) 和HSA( human serum albumin

3、, 人血清白蛋白)為研究對(duì)象。,,人血清白蛋白主要應(yīng)用于臨床、新陳代謝和遺傳方面的研究，而牛血清白蛋白常常作為蛋白模型進(jìn)行體外研究，如用于細(xì)胞培養(yǎng)，抗體載體等。BSA分子由583個(gè)氨基酸殘基組成。而HSA比BSA多2個(gè)氨基酸，即585個(gè)氨基酸殘基組成。兩者的差異在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的殘基。,熒光光譜法,由于血清白蛋白含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基,從而能發(fā)出熒光。在這些基團(tuán)中Trp起主要作用,Tyr次之,

4、Phe很弱可忽略，所以，一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸的貢獻(xiàn)。當(dāng)金屬離子與血清白蛋白結(jié)合后,可引起蛋白質(zhì)或少數(shù)金屬離子(稀土離子)熒光的改變,由此可進(jìn)行定性、定量研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。常用熒光猝滅法測(cè)定金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合數(shù)和結(jié)合常數(shù),用共振能量轉(zhuǎn)移法測(cè)定金屬離子與蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基之間的距離。,,熒光淬滅可以分為靜態(tài)淬滅和動(dòng)態(tài)淬滅。能降低熒光體發(fā)光強(qiáng)度的分子稱為猝滅劑?；鶓B(tài)熒光分子與猝滅劑之間通過弱的結(jié)合生成復(fù)合物,且該

5、復(fù)合物使熒光完全猝滅的現(xiàn)象稱為靜態(tài)猝滅。而激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑碰撞使其熒光猝滅則稱為動(dòng)態(tài)猝滅。,圖:Cu2+對(duì)BSA溶液熒光發(fā)射光譜的影響,,研究發(fā)現(xiàn)Cu2+能夠明顯猝滅BSA自身的特征熒光光譜,并且這種猝滅作用隨著Cu2+的濃度的增大而增強(qiáng)。由于BSA自身的特征熒光主要是其色氨酸殘基(Trp)產(chǎn)生的,表明隨著Cu2+濃度的增加,BSA的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化,使Trp暴露出來,造成BSA的熒光猝滅,猝滅機(jī)理主要為靜態(tài)猝滅。,,N-端

6、三肽鏈 (HSA為Asp1-Ala2-His3 ,BSA為A sp1-Thr2-His3)公認(rèn)是Cu2+(Ⅱ)的強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)。通常金屬離子與Asp1的α-NH:和His3的咪唑基N及2個(gè)去質(zhì)子肽氮(加上軸向的Asp1的羧基)配位,形成平面四邊形(四方錐)構(gòu)型。N-端三肽鏈能夠結(jié)合金屬離子的原因應(yīng)該是在于His咪唑基N的配位能力,還有三肽鏈的靈活易變,可以折疊圍繞金屬離子形成所需的特定空間構(gòu)型。,銅離子與血紅蛋白,1. 血紅蛋白簡介血紅

7、蛋白（Hemoglobin,簡稱Hb）在體內(nèi)擔(dān)任的功能是輸送氧氣，它能把從肺攜帶的氧經(jīng)由動(dòng)脈血運(yùn)送給組織，又能攜帶組織代謝所產(chǎn)生的二氧化碳經(jīng)靜脈血送到肺再排出體外。血紅蛋白化學(xué)式為 C3032H4816O812N780S8Fe4 其分子量約為64500，是含有4個(gè)肽鏈的四聚體。它是由四個(gè)亞基構(gòu)成，分別為兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基，血紅蛋白的每個(gè)亞基由一條肽鏈和一個(gè)血紅素分子構(gòu)成。,,肽鏈在生理?xiàng)l件下會(huì)盤繞折疊成球形，把血紅素分子抱在里

8、面，這條肽鏈盤繞成的球形結(jié)構(gòu)又被稱為珠蛋白。血紅素分子是一個(gè)具有卟啉結(jié)構(gòu)的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四個(gè)吡咯環(huán)上的氮原子與一個(gè)亞鐵離子配位結(jié)合，珠蛋白肽鏈中第8位上一個(gè)組氨酸殘基中的氮原子從卟啉分子平面的上方與亞鐵離子配位結(jié)合。,血紅素與血紅蛋白結(jié)構(gòu),,當(dāng)血紅蛋白不與氧結(jié)合的時(shí)候，有一個(gè)水分子從卟啉環(huán)下方與亞鐵離子配位結(jié)合，而當(dāng)血紅蛋白載氧的時(shí)候，就由氧分子頂替水的位置。血紅素與它周圍的疏水性氨基酸殘基依靠范德華力保持確定的空間

9、構(gòu)象。,銅離子與血紅蛋白相互作用,血紅蛋白在280nm附近有一個(gè)吸收峰，這是由于蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸共軛鍵的紫外吸收所致，在400nm附近有一個(gè)索瑞(soret)吸收峰，這是血紅素卟啉環(huán)的π~π*躍遷帶，為強(qiáng)吸收峰。測(cè)試牛血紅蛋白醋酸緩沖液在加入銅離子醋酸緩沖液前后的紫外光譜發(fā)現(xiàn)，在血紅蛋白溶液中加入銅離子后，不論加入的銅離子濃度有多大，在280nm處的吸收峰均消失，而其400nm附近的強(qiáng)吸收峰則隨著銅離子濃度的增大降低越來越明顯(下

10、圖左)，表明銅離子濃度越大，對(duì)蛋白質(zhì)π~π*躍遷帶的破壞性越大。,,左：2μmol/L血紅蛋白與不同濃度銅離子反應(yīng)分鐘后的紫外光譜圖右：血紅蛋白與銅離子相互作用時(shí)隨時(shí)間變化的紫外光譜圖,,由此推測(cè)，Cu2+的加入，破壞了血紅蛋白中芳香族的共軛結(jié)構(gòu)；而血紅素400nm處的soret吸收峰隨著時(shí)間的變化逐漸減弱,于是，在不含銅離子的2μmol/L血紅蛋白溶液中滴加不同濃度的Fe2+ ，發(fā)現(xiàn)隨著Fe2+的加入，400nm處的吸收峰增強(qiáng)。表

11、明400nm處的吸收峰是血紅素Fe2+形成的卟啉環(huán)的特征吸收峰。血紅蛋白在370nm處無明顯的吸收峰，當(dāng)銅離子加入后，此處吸收峰明顯增強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行了9小時(shí)后，形成了一個(gè)很寬的吸收帶，推測(cè)是Cu2+取代Fe2+后與血紅素卟啉環(huán)所形成銅絡(luò)合物的吸收峰。,,左：銅離子、鐵離子與血紅蛋白反應(yīng)的紫外光譜圖右：銅離子與血紅蛋白反應(yīng)16小時(shí)的紫外光譜圖,,最后采用電化學(xué)微分脈沖伏安法研究了Cu2+與Fe2+間的作用過程，進(jìn)一步證實(shí)了紫外光譜得到的

12、結(jié)論。亞鐵血紅素離子以鐵為中心體，形成6配位的正八面體弱場(chǎng)。按晶體場(chǎng)理論，Cu2+外層電子的3d9結(jié)構(gòu)比Fe2+的3d6結(jié)構(gòu)更容易形成穩(wěn)定的配合物，導(dǎo)致Cu2+在與血紅素中的Fe2+進(jìn)行競爭配位反應(yīng)時(shí)獲得優(yōu)勢(shì)，使得銅離子取代了血紅素中的亞鐵離子，從而使得體系的電化學(xué)性質(zhì)及紫外光譜圖都發(fā)生了一定程度的變化。,銅蛋白和銅酶,金屬酶的成鍵方式、配位環(huán)境和空間結(jié)構(gòu)與配位化合物極為類似。配位化學(xué)的理論觀點(diǎn)和方法可以用來模擬金屬酶生物活性配合物的

13、結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-功能的關(guān)系, 推定作用機(jī)理。通過配體的設(shè)計(jì)和剪裁合成出與天然酶活性中心結(jié)構(gòu)相似的模型配合物, 模擬酶的結(jié)構(gòu)和功能, 這對(duì)沒有獲得單晶結(jié)構(gòu)、功能及反應(yīng)機(jī)理尚不完全清楚的金屬酶特別適用, 可以得到一些從天然酶研究中不可能得到的信息。對(duì)銅蛋白以及含銅金屬模擬酶的研究是近年來仿生化學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)之一。,,銅蛋白質(zhì)參與生物體內(nèi)的電子傳遞、氧化還原、氧的輸送以及活化過程。銅蛋白質(zhì)按其光譜性質(zhì)可分為三類: Ⅰ型銅, 600

14、nm 附近有非常強(qiáng)的吸收, 具有小的超精細(xì)偶合常數(shù); Ⅱ型銅, 具有一般銅(Ⅱ) 配合物相近的分子吸光系數(shù)和超精細(xì)偶合常數(shù); Ⅲ型銅, 兩個(gè)銅原子彼此呈反強(qiáng)磁性相互作用, 在 330nm 附近存在強(qiáng)吸收。,按活性結(jié)構(gòu)中含銅原子的個(gè)數(shù)又可分為單核、雙核和多核銅蛋白。,含銅電子傳遞蛋白--Ⅰ型銅蛋白,目前已知的Ⅰ型銅蛋白都是參與電子傳遞反應(yīng)的銅蛋白，該類蛋白一般呈深藍(lán)色，所以也稱藍(lán)銅蛋白。根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)，I型銅蛋白中銅的配位環(huán)境為N2S

15、S*，即兩個(gè)His側(cè)鏈上的咪唑氮原子、一個(gè)Cys側(cè)鏈上的硫原子和一個(gè)Met側(cè)鏈上的硫原子參與銅的配位，形成一個(gè)扭曲的四面體結(jié)構(gòu)。,藍(lán)銅蛋白（I型銅蛋白）的譜學(xué)特征主要有：,紫外光譜在590～625 nm范圍內(nèi)有很強(qiáng)的LMCT吸收（配體到金屬的電荷躍遷）；電子自旋光譜中，由銅的核自旋引起的超精細(xì)偶合常數(shù)非常小，這是由于Cu-S鍵的共價(jià)性較大、鍵長較短造成的；與一般銅配合物的氧化還原電位（約160 mV）相比，I型銅蛋白的氧化還原電位都

16、比較高（200～700 mV）。,Ⅰ型銅蛋白—質(zhì)體藍(lán)素,質(zhì)體藍(lán)素存在于植物和藻類的葉綠體中，在光合作用下，從細(xì)胞色素接受電子再傳遞給葉綠體。質(zhì)體藍(lán)素的分子質(zhì)量約為11000 D，氧化還原電位為370 mV左右。它的活性中心的銅處于變形的四面體構(gòu)型，由兩個(gè)His側(cè)鏈上的咪唑氮原子、一個(gè)Cys側(cè)鏈上的硫原子和一個(gè)Met側(cè)鏈上的硫原子與銅配位。,,氧化型質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)基本上不隨pH變化而變化，而還原型質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)隨pH變化而變化，當(dāng)pH較

17、低時(shí)，His87發(fā)生質(zhì)子化，而且其咪唑環(huán)發(fā)生旋轉(zhuǎn)不再與銅離子配位。,Ⅰ型銅蛋白—阿祖林(天青蛋白),它是從熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌等細(xì)菌中分離得到的，相對(duì)分子質(zhì)量為14600～17000，含有一個(gè)銅離子，氧化還原電位為280～340 mV。在電子傳遞體系中，阿祖林將電子傳遞給細(xì)胞色素，但供電子體尚不清楚。在阿祖林的活性中心中，兩個(gè)His的咪唑氮原子和一個(gè)Cys的硫原子形成一個(gè)三角形，Met上的硫原子和一個(gè)蛋白鏈中的酰胺氧原子分別從三

18、角形的兩邊與中心銅離子有弱配位作用。,,Ⅱ型銅蛋白--銅鋅超氧化物歧化酶,與Ⅰ型銅蛋白相比，Ⅱ型銅蛋白活性中心在譜學(xué)上有幾點(diǎn)變化：(1) 銅的氧化還原電位向正的方向移動(dòng)；(2) 與銅配位的原子由硫變?yōu)榈蜓酰~采取典型的四方錐配位構(gòu)型；(3) 電子光譜中吸收強(qiáng)度減弱；(4) 電子自旋光譜中超精細(xì)偶合常數(shù)變大。,,Ⅱ型銅蛋白中的銅一般處于配位不飽和狀態(tài)，即留有空位，從而可以結(jié)合底物分子，并進(jìn)行催化反應(yīng)。代表蛋白：銅鋅超氧化物歧化

19、酶（銅鋅SOD），它能有效地催化分解超氧負(fù)離子，是一種很好的抗氧化劑，起到保護(hù)生物體的作用。Cu2Zn2－SOD中含有兩個(gè)相同的亞基，其中每個(gè)亞基中含有一個(gè)Cu2+和一個(gè)Zn2+，他們通過一個(gè)組氨酸側(cè)鏈上的咪唑基團(tuán)橋聯(lián)。兩個(gè)亞基之間主要是通過非共價(jià)鍵的疏水作用締合在一起。,銅鋅SOD,,銅鋅SOD中每個(gè)銅離子與四個(gè)組氨酸側(cè)鏈上的咪唑氮原子配位，形成一個(gè)變形的四邊形，還有一個(gè)水分子在軸向上與銅離子配位，使銅離子為五配位的變形四方錐構(gòu)型。

20、每個(gè)鋅離子為四配位的變形四面體構(gòu)型，由三個(gè)組氨酸側(cè)鏈的咪唑氮原子和一個(gè)天冬氨酸的羧基氧原子與鋅離子配位而成。在這個(gè)酶中,Cu2+可能決定了酶的催化特異性，而Zn2+ 則可能起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。但全酶的活性需要兩只協(xié)同作用。,含銅氧載體--Ⅲ型銅蛋白,Ⅲ型銅蛋白的主要特點(diǎn)是在其活性中心含有兩個(gè)銅離子，并且兩個(gè)銅離子之間存在強(qiáng)的相互作用。典型代表有血藍(lán)蛋白和酪氨酸酶。血藍(lán)蛋白是一種氧載體，存在于蝸蟲、章魚等甲殼類和軟體類動(dòng)物的

21、血液中。,還原型血藍(lán)蛋白,,還原型血藍(lán)蛋白的活性中心含有兩個(gè)一價(jià)銅離子，每個(gè)銅離子與三個(gè)組氨酸側(cè)鏈的咪唑氮原子配位，兩個(gè)銅離子之間未發(fā)現(xiàn)橋聯(lián)配體。兩個(gè)銅離子之間的空腔正好容納一個(gè)氧分子。氧化型血藍(lán)蛋白中盡管銅離子為二價(jià)d9構(gòu)型，但由于兩個(gè)二價(jià)銅離子之間存在很強(qiáng)的反鐵磁相互作用，以致在室溫條件下，該雙核銅活性中心呈抗磁性。氧分子結(jié)合到血藍(lán)蛋白后，以過氧負(fù)離子狀態(tài)存在,,酪氨酸酶,酪氨酸酶存在于哺乳動(dòng)物中，具有兩種不同的催化活性，它既可以