基質(zhì)金屬蛋白酶活性中心肽段的合成、純化及與金屬離子作用研究.pdf

1、基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinase, MMPs)是一個(gè)蛋白水解酶家族,可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分。越來越多的研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起著重要的作用,而且此作用不僅僅限于它有利于細(xì)胞外基質(zhì)的降解,還對腫瘤微環(huán)境的維持和促進(jìn)腫瘤生長起著重要的作用。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶又叫基質(zhì)溶解素。第一個(gè)基質(zhì)金屬蛋白酶是在1963年由 Gross和 Lapiere發(fā)現(xiàn)的,此后,又有多種基質(zhì)金屬蛋白酶逐漸被

2、發(fā)現(xiàn)和表征。根據(jù)它們結(jié)構(gòu)和作用底物的特點(diǎn),基質(zhì)金屬蛋白酶可以分為:膠原酶,明膠酶,基質(zhì)降解素以及膜型 MMPs等。所有的基質(zhì)金屬蛋白酶都有一些共同的特點(diǎn),這些特點(diǎn)包括:(1)都含有共同的結(jié)構(gòu)域,包括信號肽與前肽區(qū)、催化區(qū)、C-端類血紅素區(qū)和跨膜區(qū);(2)都是以酶原形式分泌;(3)均能夠被其他蛋白激酶或有機(jī)汞劑激活;(4)酶原激活后伴隨著分子量減小;(5)活性中心都含有金屬鋅離子;(6)它們的活性能被金屬蛋白組織抑制劑所抑制;(7)酶原激

3、活后能降解一種或幾種細(xì)胞外基質(zhì)成分;(8)這種酶在中性pH環(huán)境中發(fā)揮作用,并且需要鈣離子來維持穩(wěn)定。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶的催化區(qū)包含一個(gè)高度保守的鋅結(jié)合區(qū),其氨基酸序列為His-Glu-X-Gly-His-X-X-Gly-X-X-His,鋅離子作為活性中心和序列中的三個(gè)His殘基配位結(jié)合。序列中的Glu殘基在蛋白水解時(shí)能提供質(zhì)子并催化反應(yīng)進(jìn)行,同時(shí)使鋅離子與配位水分子結(jié)合更加穩(wěn)定。
　　由于基質(zhì)金屬蛋白酶活性中心中含有三個(gè)高

4、度保守的His序列,該活性中心應(yīng)該非常容易通過 His咪唑環(huán)上 N原子與多種金屬離子發(fā)生配位。因此,合成該酶的催化活性中心肽段,對于模擬研究基質(zhì)金屬蛋白酶活性中心的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能關(guān)系及該酶抑制劑的設(shè)計(jì)合成都有重要意義。本文中采用 Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相多肽合成法,合成了兩種天然基質(zhì)金屬蛋白酶的活性中心作為研究對象。主要工作如下:
　　一、基質(zhì)金屬蛋白酶活性中心肽段的合成、純化及表征。采用Fmoc-L-Thr(tbu)-W

5、ang樹脂作為固相載體,利用Fmoc(9-芴甲氧羰基)基團(tuán)作為α-氨基保護(hù)基,經(jīng)去保護(hù)、活化耦合、洗滌和裂解等步驟合成了兩種基質(zhì)金屬蛋白酶的活性中心肽段,即Ala-His-Glu-Phe-Gly-His-Val-Leu-Gly-Leu-Gln-His-Thr(簡稱P13肽)和Ala-Ala-His-Glu-Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Leu-Ser-His-Ser-Thr(簡稱P15肽)。P13肽和P15肽的分析和純

6、化在HPLC上進(jìn)行。粗肽溶解于純水中,在分析型色譜柱上進(jìn)行分析(250×4.6mm,5μm,流速1ml/min;流動相A,0.1％TFA;流動相B,90%CH3CN+0.1%TFA;UV檢測波長214nm;梯度條件:10%-70%B55 min)。根據(jù)分析色譜結(jié)果,優(yōu)化條件后在半制備色譜柱上進(jìn)行純化(250×10mm,流速4.7ml/min,流動相A,0.1%TFA;流動相B,90%CH3CN+0.1%TFA)。最終純化出了高純度的P1

7、3肽和P15肽(98.7%P13肽,99.0%P15肽)。
　　用電噴霧質(zhì)譜分別測定了P13肽和P15肽的分子量,與理論分子量吻合。1H NMR數(shù)據(jù)證實(shí)了P13肽和P15肽中特征性官能團(tuán)的存在。因此驗(yàn)證了P13肽和P15肽合成和純化的正確性。這為下一步研究P13肽和P15肽的性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。
　　二、核磁共振光譜研究P13肽和P15肽與金屬離子的作用。利用一維核磁共振光譜分別對P13肽和P15肽與Cu2+、Zn2+、Ni2+

8、、Co2+等金屬離子的相互作用進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,P13肽和P15肽均能與這些金屬離子發(fā)生配位作用,其作用位點(diǎn)為該活性中心肽段的三個(gè)高度保守的His的咪唑環(huán)。而且,不同的金屬離子對活性中心肽段的結(jié)構(gòu)影響也不盡相同。從核磁譜圖可以看出,P13肽和P15肽分別與Cu2+和Co2+作用時(shí),His區(qū)域的信號峰明顯消失,尤其是與Cu2+作用時(shí)更為明顯,Cu2+與His咪唑環(huán)的N配位后使His咪唑環(huán)上N相鄰的H信號明顯降低或完全消失。而P13

9、肽和P15肽與Zn2+作用時(shí),His區(qū)域的H信號僅有較小程度的降低,尤其在高場區(qū)變化更小。這說明P13肽和P15肽與Cu2+、Co2+配位能力強(qiáng)于Zn2+,并且與Cu2+和Co2+作用后對其結(jié)構(gòu)的影響也強(qiáng)于Zn2+。
　　三、紫外可見吸收光譜研究 P13肽和 P15肽與金屬離子的作用。利用紫外可見吸收光譜法分別對P13肽和P15肽與Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等金屬離子的相互作用進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,P13肽和P15

10、肽與金屬離子作用后,其225 nm附近的吸收峰均出現(xiàn)明顯增大,這可能是由于肽與金屬配位對其酰胺鍵產(chǎn)生的影響造成的。隨著金屬離子濃度的增加,225 nm處的吸光度逐漸增大,但當(dāng)金屬離子與肽濃度達(dá)到1:1時(shí),225 nm處的吸光度不再變化,這說明P13肽和P15肽與金屬離子均為1:1配位結(jié)合。當(dāng)P15肽與Cu2+和Co2+作用時(shí),隨著Cu2+濃度的增大,在可見光區(qū)出現(xiàn)了新的吸收峰,這是由于Cu2+和Co2+d-d電子躍遷產(chǎn)生的。從P13肽和

11、P15肽與Zn2+作用的紫外光譜中可以看出,Zn2+與肽配位后225 nm處的吸光度變化不大。這也說明了 Zn2+與肽配位對肽本身的結(jié)構(gòu)影響較小,這與核磁共振光譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。
　　四、圓二色光譜研究P13肽和P15肽與金屬離子的作用。圓二色光譜能快速測定蛋白質(zhì)和多肽的二級結(jié)構(gòu),在研究蛋白質(zhì)和多肽的性質(zhì)中發(fā)揮著重要的作用。酰胺鍵是用CD譜觀察肽和蛋白最重要的發(fā)色團(tuán),已經(jīng)確定它有兩種遷移方式n-π*遷移通常很弱,在220nm處

12、呈一負(fù)帶。它的能量(波長)對氫鍵的形成敏感。π-π*遷移一般較強(qiáng),在192 nm附近出現(xiàn)一正帶,在210 nm處出現(xiàn)一個(gè)負(fù)帶。本文利用圓二色光譜分別對P13肽和P15肽與Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等金屬離子的相互作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,無論是P13肽還是P15肽與金屬離子配位后,均對其二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。P13肽和P15肽與不同的金屬離子作用時(shí)對其二級結(jié)構(gòu)的影響也不相同,無論是P13肽還是P15肽與Cu2+作用后對其