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文檔簡介
1、基質金屬蛋白酶(Matrix Metaloproteinases,MMPs)是一種可降解細胞外基質的蛋白水解酶,在惡性腫瘤的生長、侵襲、轉移和血管生成過程中起著重要的作用?;|金屬蛋白酶抑制劑作為新型抗腫瘤藥物,在腫瘤治療方面具有良好的開發(fā)與應用潛力。建立實時在體檢測MMPs 活性的方法,對于高通量在體篩選MMPs 抑制劑具有重要的作用。1應用基因工程技術合成用于在體檢測水解酶活性的熒光共振能量轉移(FRET)探針,通過FRET 成像能
2、動態(tài)監(jiān)測在體外和不同細胞表達水解酶的活性。 本研究中應用基因工程技術合成了兩對可用于在活細胞或活動物體內檢測MMPs活性的熒光共振能量轉移(FRET)探針,此FRET 探針設計原理為:將能發(fā)生FRET的熒光蛋白對CFP/YFP 或CFP/DsRed 用MMPs 識別的肽相連,構建成YFP-MMPs底物識別序列-CFP 或DsRed- MMPs 底物識別序列-CFP 的融合蛋白。在體外利用純化的熒光探針對MMP 酶的活性及抑制劑的
3、作用進行了實時動態(tài)的光譜學分析,而且此探針對MMP2 具有較高的酶切特異性。將這兩個探針用展示技術錨定在細胞膜的外表面,用于檢測分泌到細胞外的MMPs 活性。當細胞外液無MMPs 時, 此FRET 探針保持其完整性時,CFP 與YFP 或CFP 與DsRed 之間能夠發(fā)生熒光共振能量轉移;當腫瘤細胞高表達MMPs,分泌到細胞外液中的MMPs 活性較高時,F(xiàn)RET 探針被MMPs 裂解,使得熒光受體蛋白YFP 或DsRed 游離到細胞外液
4、中,而熒光供體蛋白CFP 仍保留在腫瘤細胞上。因此,無論是通過FRET 熒光成像還是單獨檢測YFP 或DsRed 熒光信號,均能靈敏地反映腫瘤細胞的MMPs 活性。 本研究中,將此FRET 探針分別轉染到MDA-MB 435s 細胞(高表達MMP s)和MCF-7 細胞(低表達MMPs),篩選穩(wěn)定表達熒光探針的細胞株,利用FRET 技術在活細胞內實時監(jiān)測了MMPs 的活性及MMPs 抑制劑GM6001 的作用。此外,將穩(wěn)定表達F
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