缺氧肝細(xì)胞對肝星狀細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅱ表達(dá)及活性調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、肝纖維化是許多慢性肝病的共同的病理過程,是肝臟的損傷修復(fù)性反應(yīng),主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡,導(dǎo)致肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常沉積的病理過程。肝星狀細(xì)胞(HSCs)活化被公認(rèn)為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。HSCs活化過程除受枯否細(xì)胞、炎細(xì)胞、受損肝細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子或其它可溶性因子的影響外,目前已清楚基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)通過降解細(xì)胞外基質(zhì)改變HSCs微環(huán)境,也可以促進(jìn)HSCs的活化,活化后的HSCs又分泌大量的MMP-2,形

2、成惡性循環(huán)。在肝纖維化形成過程中,Ⅳ型膠原的沉積提示MMP-2對其降解力度不夠或酶的作用環(huán)境改變:而在肝纖維化的逆轉(zhuǎn)期,MMP-2活性顯著增強(qiáng)。顯然,MMP-2與肝纖維化關(guān)系密切。所以搞清調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)及活性的因素不論對該病的預(yù)防還是治療均有十分重要的意義。
　　 肝臟感染或其他因素造成的損傷均可導(dǎo)致肝臟缺氧,而缺氧將加重肝損傷,促進(jìn)纖維化發(fā)展。本組前期研究結(jié)果提示:氧能調(diào)節(jié)HSCs MMP-2表達(dá)及活性水平,缺氧情況下,大

3、鼠HSCs表達(dá)MMP-2升高,但其酶活性下降;體內(nèi)研究結(jié)果提示氧能通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞MMP-2表達(dá)及活性而影響肝纖維化的發(fā)展;另外還發(fā)現(xiàn)纖維化肝組織表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α),而且?guī)缀跞抢w維間隔附近肝細(xì)胞表達(dá)。提示作為肝臟的主體細(xì)胞以及HSCs的近鄰—肝細(xì)胞在氧對HSCs MMP-2表達(dá)及活性調(diào)節(jié)中可能起重要作用。
　　 綜上所述,氧和MMP-2與肝纖維化發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系,且氧對HSCs MMP-2表達(dá)及活性有重

4、要調(diào)節(jié)作用,然而缺氧狀況下,肝細(xì)胞對HSCs MMP-2表達(dá)及活性的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。
　　 第一部分缺氧肝細(xì)胞是否會影響大鼠肝星狀細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅱ表達(dá)及活性?
　　 [目的]:缺氧的肝細(xì)胞對大鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅱ(matrix metalloproteinase2,MMP-2)表達(dá)及活性的影響。
　　 [方法]:缺氧培養(yǎng)肝細(xì)胞BRL-3A(氧

5、濃度5％)12小時后取其培養(yǎng)上清做為缺氧條件培養(yǎng)基培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞HSC-T6,6h,12h,24h后分別通過Realtime RT-PCR,Western blot,明膠酶譜法檢測HSC-T6細(xì)胞MMP-2 mRNA、蛋白表達(dá)及酶活性。
　　 [結(jié)果]:隨缺氧條件培養(yǎng)時間的延長,三個時間點缺氧條件培養(yǎng)基組MMP-2 mRNA(8.0278±1.09,20.44±1.44,25.16±1.76)明顯高于正常條件培養(yǎng)組(4.29±1

6、.34,10.08±1.53,21.61±1.18)和DMEM組(1±1.20,3.47±1.11,20.04±1.80),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。MMP-2蛋白表達(dá)缺氧條件培養(yǎng)基組(0.99±0.02,1.12±0.06,1.38±0.08)也顯著高于正常條件培養(yǎng)基組(0.86±0.04,0.92±0.04,1.17±0.04)和DMEM組(0.50±0.05,0.67±0.03,1.05±0.02),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

7、(P＜0.001),而MMP-2酶活性缺氧條件培養(yǎng)基組(3377.87±380.05,12090.19±823.17,11146.79±247.46)則顯著低于正常條件培養(yǎng)基組(6795.63±348.31,19663.99±934.82,25741.95±1586.77)和DMEM組(4840.13±628.20,5455.12±383.88,3983.47±143.09),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 [結(jié)論

8、]:物理缺氧條件下,肝細(xì)胞分泌或釋放了可溶性物質(zhì),作用于肝星狀細(xì)胞使其MMP-2在mRNA和蛋白水平上表達(dá)上調(diào),活性下降。究竟是何種物質(zhì)尚待進(jìn)一步研究。
　　 第二部分缺氧肝細(xì)胞釋放的ROS影響大鼠肝星狀細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅱ表達(dá)及活性
　　 [目的]:研究缺氧肝細(xì)胞釋放的ROS對大鼠肝星狀細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅱ表達(dá)及活性的影響。
　　 [方法]:①通過原子吸收分光光度法(atomic absorption spec

9、trophotometry)檢測缺氧條件培養(yǎng)基及缺氧條件培養(yǎng)后的肝星狀細(xì)胞上清中鋅(Zn)離子濃度。②對肝細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理12h(氧濃度21%,10%,5%),通過活性氧比色法檢測缺氧條件培養(yǎng)基中活性氧(reactive oxygen species,ROS)濃度。③將還原型谷胱甘肽(glutathion,GSH)(0,0.5,2.5,10 mmol/L)加入缺氧肝細(xì)胞中,采用活性氧比色法檢測缺氧后肝細(xì)胞上清中ROS含量。④以還原型谷胱

10、甘肽(glutathion,GSH)(0,0.5,2.5,10 mmol/L)中和缺氧缺氧條件培養(yǎng)基中的ROS,以此條件培養(yǎng)基培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞HSC-T6,6h,12h,24h后,通過Realtime RT-PCR,Western blot,明膠酶圖法分別檢測HSC-T6細(xì)胞MMP-2mRNA、蛋白表達(dá)及其酶活性。
　　 [結(jié)果]:①隨著培養(yǎng)時間的延長,缺氧條件培養(yǎng)基中Zn濃度逐漸下降。②隨著氧濃度(21%,10%,5%)的降低,

11、肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中的ROS逐漸升高(0.1941±0.007,0.2317±0.020,0.2588±0.009),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。③隨著GSH濃度增加(0,0.5,2.5,10 mmol/L),ROS濃度逐漸下降(0.2589±0.003,0.2469±0.002,0.2288±0.003,0.1598±0.004),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。④隨著GSH濃度增加,MMP-2mRNA、蛋白表達(dá)及MMP-2酶

12、活性均逐漸下降。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 [結(jié)論]:①Zn濃度的下降與MMP-2活性變化不一致。②隨著氧濃度的降低,缺氧肝細(xì)胞產(chǎn)生的ROS逐漸增加。③GSH能夠有效的清除缺氧條件培養(yǎng)基中的ROS。④ROS是缺氧肝細(xì)胞釋放的可以使肝星狀細(xì)胞MMP-2 mRNA、蛋白表達(dá)和括性均升高的因子。
　　 第三部分缺氧肝細(xì)胞釋放的ROS影響肝星狀細(xì)胞HSC-T6MMP-2表達(dá)的信號通路
　　 [目的]:

13、研究缺氧肝細(xì)胞釋放的ROS影響肝星狀細(xì)胞HSC-T6 MMP-2表達(dá)的信號通路。
　　 [方法]:①Western blot檢測缺氧條件培養(yǎng)后的肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞內(nèi)磷酸化IκB-α的表達(dá)變化。②將NF-κB信號通路特異性抑制劑BAY11-7082加入缺氧條件培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞HSC-T6中,Western blot檢測磷酸化IκB-α的表達(dá)水平。③以BAY11-7082阻斷缺氧條件培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞中NF-κB信號通路,We

14、stern blot檢測其MMP-2表達(dá)水平。
　　 [結(jié)果]:①缺氧條件培養(yǎng)基組肝星狀細(xì)胞HSC-T6中磷酸化IκB-α的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。②加入BAY11-7082后,Western blot結(jié)果顯示磷酸化IκB-α的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.001)。③Western blot顯示加入BAY11-7082后,缺氧條件培養(yǎng)基組肝星狀細(xì)胞HSC-T6 MMP-2的表達(dá)水平(0.2329±0.018)明顯低于未加BA