三維立體培養(yǎng)中肺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的表達.pdf

1、肺癌的發(fā)病率和死亡率居所有癌癥的首位，其發(fā)病機制的研究也一直是熱點。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組鋅離子依賴性的、在結(jié)構(gòu)上具有極大同源性的內(nèi)肽酶家族，能降解細(xì)胞外基質(zhì)，其過度表達在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中有著重要作用，因而被廣泛關(guān)注和研究。本課題采用三維立體培養(yǎng)技術(shù)，研究肺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的表達情況，以探討基質(zhì)金屬蛋白酶在肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用及機制。
　　首先建立肺癌細(xì)胞的三維立體培養(yǎng)模型。采用人非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞株

2、傳代培養(yǎng)，用鼠尾制?、裥湍z原，并制備等離子、等滲、1×DMEM、膠原濃度為0.75mg/mL的液體膠原，按4×105個/mL接種H460細(xì)胞于膠原內(nèi)，建立三維立體培養(yǎng)，同時建立平面培養(yǎng)作為對照，在24、72、120h觀察細(xì)胞生長狀況，用數(shù)碼照相機記錄，并收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用明膠酶譜電泳的方法測定其中的MMP-2、MMP-9。然后將單個核細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞分別與H460細(xì)胞混和立體培養(yǎng)。單個核細(xì)胞采集自健康志愿者外周血，采用單個核細(xì)胞分離液

3、分離制備，人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞株傳代培養(yǎng)，分別將兩種細(xì)胞與H460細(xì)胞混和立體培養(yǎng)，定時觀察、記錄細(xì)胞生長情況，收集培養(yǎng)液，用明膠酶譜電泳的方法測定其中的MMP-2、MMP-9，采用Bergman法測定其中的羥脯氨酸含量，計算膠原降解量。再者在H460細(xì)胞立體培養(yǎng)中加入TNF-α干預(yù)因素，同樣方法測定MMP-2、MMP-9和羥脯氨酸含量。最后采用明膠酶譜電泳法測定36例非小細(xì)胞肺癌患者血清和23例惡性胸水的MMP-2、MMP-

4、9，同時測定10例健康志愿者血清和15例非惡性胸水作為對照，并用Bandscan分析軟件測定電泳條帶灰度值。
　　本實驗成功建立了肺癌細(xì)胞的三維立體培養(yǎng)模型，癌細(xì)胞及肺成纖維細(xì)胞等生長狀況良好，H460細(xì)胞在立體培養(yǎng)條件下MMP-2、MMP-9表達比平面培養(yǎng)增強。H460細(xì)胞與單個核細(xì)胞混和立體培養(yǎng)，電泳顯示MMP-2、MMP-9的表達混合組最強，其次是H460組，單個核細(xì)胞組表達不明顯；膠原分解量也是混和組最高，單個核細(xì)胞組最低

5、，組間比較差異顯著（P<0.05）。H460細(xì)胞與MRC-5混和立體培養(yǎng)，電泳顯示MMP-2、MMP-9的表達MRC-5組最強，其次為混合組，H460組表達最弱；膠原降解量同樣是MRC-5組最高，H460組最低，組間比較差異顯著（P<0.05）。在H460細(xì)胞的立體培養(yǎng)中加入TNF-α干預(yù)，電泳顯示MMP-2、MMP-9表達較空白對照組增強，膠原分解量增多，有顯著性差異（P<0.05）。血清標(biāo)本電泳MMP-2在非小細(xì)胞肺癌患者及健康志愿

6、者均有表達，MMP-2條帶灰度測定差異不顯著（P>0.05）。胸水標(biāo)本電泳MMP-2、MMP-9結(jié)果顯示：在惡性胸水中表達最高，漏出性胸腔積液表達最低。MMP-2條帶灰度測定顯示：惡性胸腔積液組測定值最高，其次為滲出性結(jié)核性胸膜炎組，漏出性胸腔積液組最低。惡性胸腔積液組、結(jié)核性胸膜炎組與漏出性胸腔積液組比較差異顯著（P<0.05），但前兩者之間無明顯差異（P>0.05）。
　　研究認(rèn)為三維立體培養(yǎng)是一種能較好模擬體內(nèi)環(huán)境的研究模型

7、，在肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的復(fù)制與研究方面有很大優(yōu)勢。我們運用這一模型發(fā)現(xiàn)：單個核細(xì)胞與肺癌細(xì)胞混和培養(yǎng)后，刺激MMP-2、MMP-9分泌增多，活性增強；肺成纖維細(xì)胞與肺癌細(xì)胞混合培養(yǎng)，刺激MMP-2、MMP-9表達的同時，可能更多的刺激了TIMPs的表達增強；TNF-α對肺癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達有上調(diào)的作用。血清中MMP-2的表達差異不顯著，可能需要進一步增加樣本深入研究后才能明確其臨床意義；胸水中MMP-2、MMP-9的表達