基于金屬離子的槐糖脂合成過程中關(guān)鍵酶的初步研究.pdf

1、槐糖脂（Sophorolipids，SLs）是一種由非致病性酵母發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖類生物表面活性劑。目前已知產(chǎn)槐糖脂的菌株有很多，但由它們發(fā)酵合成槐糖脂的產(chǎn)量和組成不一。造成產(chǎn)量和類型不同的原因之一是槐糖脂的發(fā)酵底物不同。不同類型的槐糖脂作用不同，對(duì)槐糖脂進(jìn)行適當(dāng)修飾，可以得到生活、生產(chǎn)中更加需要的槐糖脂類型。
　　金屬離子也是影響槐糖脂合成的因素之一，但很少有關(guān)于金屬離子與槐糖脂關(guān)系的文章。金屬離子是細(xì)胞生長(zhǎng)的必需元素，酶活

2、性的發(fā)揮離不開金屬離子的參與。金屬離子對(duì)槐糖脂的影響很可能是金屬離子影響了某種酶的活性。這些酶包括細(xì)胞色素 P450(cytochromeP450,CYP450)、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Glucoxytransferase，UGTB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD)、乙?；D(zhuǎn)移酶、內(nèi)酯化酶。合成槐糖脂的第一步是將疏水性碳源末端或近末端羥基化，這一步的完成需要細(xì)

3、胞色素P450的催化作用，細(xì)胞色素氧化酶活性的發(fā)揮需要Fe2+,推測(cè)金屬離子、細(xì)胞色素P450、槐糖脂三者之間可能存在某種聯(lián)系。
　　本文首先探究了 Mg2+、Cu2+、Fe2+在不同添加時(shí)間條件下對(duì)槐糖脂的影響；然后建立測(cè)定槐糖脂合成過程中P450酶活的方法，并且通過HPLC初步探究底物消耗法測(cè)定P450酶活的可行性；最后研究細(xì)胞色素P450在不同金屬離子條件下及不同添加時(shí)間下的酶活和槐糖脂的產(chǎn)量，驗(yàn)證底物消耗法測(cè)定P450酶活

4、方法的可行性。通過三方面的實(shí)驗(yàn)得出金屬離子、細(xì)胞色素 P450、槐糖脂三者之間的關(guān)系。為獲得槐糖脂的最大產(chǎn)量和定向合成不同類型的槐糖脂奠定了基礎(chǔ)，為槐糖脂在今后大規(guī)模應(yīng)用提供了參考依據(jù)。
　　本文主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.金屬離子對(duì)槐糖脂的影響。本文選取 Mg2+、Cu2+、Fe2+三種金屬離子作為研究對(duì)象。Mg2+、Cu2+、Fe2+三種金屬離子的添加時(shí)間分別為0 h、4 h、8 h、12 h、16 h，每隔四個(gè)

5、小時(shí)添加金屬離子，待發(fā)酵7天后對(duì)發(fā)酵液中的各種指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在金屬離子添加時(shí)間0h、4h、8h、12h、16h下，細(xì)胞干重呈先增加后減少的趨勢(shì)。不同金屬離子、金屬離子的不同添加時(shí)間都會(huì)對(duì)槐糖脂產(chǎn)生影響。對(duì)總槐糖脂產(chǎn)量來說，添加Mg2+時(shí)獲得槐糖脂的最大產(chǎn)量為90 g/L左右，這是菌種發(fā)酵4-12 h后添加鎂離子獲得的；Cu2+在添加時(shí)間為4 h獲得最大產(chǎn)量，產(chǎn)量為81.38 g/L；Fe2+在4 h獲得最大產(chǎn)量52.03 g

6、/L?？偦碧侵a(chǎn)量總體趨勢(shì)先增加后減少。對(duì)內(nèi)酯型槐糖脂（Lactone-Sophorolipids，L-SLs）產(chǎn)量來說，添加Mg2+、Cu2+、Fe2+都在4 h獲得最大產(chǎn)量，分別為54.84 g/L、37.57 g/L、26.23 g/L。三種金屬離子內(nèi)酯型槐糖脂產(chǎn)量的總體趨勢(shì)都是先增加后減少。就酸型槐糖脂（Acid-Sophorolipids，A-SLs）產(chǎn)量來說，添加Mg2+在12 h獲得最大產(chǎn)量，產(chǎn)量為56.23 g/L。添加

7、Cu2+在0 h獲得最大產(chǎn)量，產(chǎn)量為49.50 g/L。酸型槐糖產(chǎn)量在0-16 h時(shí)間范圍內(nèi)呈下降趨勢(shì)；添加Fe2+在0 h獲得最大產(chǎn)量31.97 g/L。0-16 h，產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。從得到槐糖脂類型的比例來看，在菌種開始發(fā)酵4 h后添加Mg2+，得到內(nèi)酯型槐糖脂的比例高于酸型槐糖脂；從發(fā)酵一開始（0 h）添加Cu2+，得到的酸型槐糖脂的比例高于內(nèi)酯型；從發(fā)酵一開始（0 h）添加Fe2+生成的酸型槐糖脂比例更高；在16 h添加Fe2+

8、有利于內(nèi)酯型槐糖脂的產(chǎn)生?？梢愿鶕?jù)金屬離子的最適添加時(shí)間得到更多想要的槐糖脂類型，對(duì)于定向合成不同類型的槐糖脂具有重要意義。
　　2.細(xì)胞色素 P450酶活方法的建立。本文首先用油酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制油酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)不同的濃度，每個(gè)濃度設(shè)置3組平行。然后用HPLC測(cè)定了發(fā)酵液中油酸的含量，得出油酸的消耗速率。最后提取擬威克酵母發(fā)酵72 h后的微球蛋白，構(gòu)建細(xì)胞色素P450酶活分析體系，利用高效液相探究Mg2+、Cu2+、Fe2+

9、對(duì)細(xì)胞色素P450的酶活的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)酵72 h后發(fā)酵液中油酸的消耗速率由快到慢依次為Mg2+、Cu2+、Fe2+，它們的消耗速率分別為9.55 x10-3μmol/min、8.84 x10-3μmol/min、1.13x10-3μmol/min；添加Mg2+、Cu2+、Fe2+發(fā)酵72 h后P450的活性分別為5.37 U、5.34 U、5.24 U，空白對(duì)照組CYP450的酶活為5.08 U。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出金屬離子影響了

10、 CYP450的酶活。通過本章實(shí)驗(yàn)，建立了一個(gè)測(cè)定細(xì)胞色素P450酶活的方法。并證明了利用油酸消耗速率測(cè)定CYP450酶活的方法基本可行。
　　3.槐糖脂合成過程中細(xì)胞色素P450的酶活分析。驗(yàn)證細(xì)胞色素P450酶活測(cè)定方法基本可行后，分別對(duì)4 h、8 h、12 h、16 h金屬離子添加時(shí)間下的P450酶活進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從0 h到16 h，隨著金屬離子添加時(shí)間的延遲，細(xì)胞色素P450的酶活先增加后減少。在8 h左右添加M

11、g2+，細(xì)胞色素P450的酶活最高，為5.54 U；添加Cu2+在4 h左右，細(xì)胞色素P450的酶活最高，為5.33 U；添加Fe2+在4 h左右，細(xì)胞色素P450的酶活最高，為5.32 U。不同時(shí)間添加Mg2+、Cu2+、Fe2+得到的酶活與前面的實(shí)驗(yàn)中槐糖脂產(chǎn)量先增加后減少的現(xiàn)象對(duì)應(yīng)。
　　在金屬離子及其添加時(shí)間的影響下，細(xì)胞色素P450的酶活受到金屬離子和金屬離子添加時(shí)間的影響，與空白對(duì)照比較，CYP450的活性受到的影響較