槐糖脂產(chǎn)生菌擬威克酵母的誘變育種、遺傳改造及槐糖脂體內(nèi)和體外抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、表面活性劑是一類最重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于家庭、工業(yè)和農(nóng)業(yè)。人們生活工作的各個(gè)方面幾乎都離不開表面活性劑。隨著人類社會(huì)的進(jìn)步與發(fā)展以及人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，生物表面活性劑替代化學(xué)合成的表面活性劑將成為必然趨勢?；碧侵且活愑山湍府a(chǎn)生的糖脂類生物表面活性劑，由于其具有高產(chǎn)量、生物可降解性、低毒性和良好的環(huán)境兼容性等許多優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于石油、環(huán)境保護(hù)、化妝品、洗滌劑、藥學(xué)及納米科技等工業(yè)領(lǐng)域，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用得到了研究者的廣泛關(guān)

2、注。因此，槐糖脂被認(rèn)為是一種最有發(fā)展和應(yīng)用潛力的、可能替代化學(xué)表面活性劑的可再生的生物表面活性劑，對其開發(fā)及應(yīng)用將會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。
　　 本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.低能離子束注入誘變選育高產(chǎn)槐糖脂菌株
　　 目前，對產(chǎn)槐糖脂菌株的誘變育種研究較少。本論文對實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的產(chǎn)槐糖脂菌株W.domercqiae Y2A采用低能N+注入的方式進(jìn)行了誘變育種。
　　 選取N+作為離子

3、束注入的離子源，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同劑量N+注入后，菌株Y2A的存活率曲線是典型的“馬鞍型”曲線，即隨著注入劑量增加，存活率呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢。選取的誘變劑量是3×1015 ions/cm2，經(jīng)過注入誘變選育后，18個(gè)突變株菌的總槐糖脂產(chǎn)量較出發(fā)株提高了20％以上，18個(gè)突變株的內(nèi)酯型槐糖脂產(chǎn)量較出發(fā)株提高了100％以上;5個(gè)突變株的酸型槐糖脂產(chǎn)量較出發(fā)株提高了30％以上。其中，菌株N3-18在搖瓶水平發(fā)酵時(shí)總槐糖脂產(chǎn)量可達(dá)104

4、g/L，較出發(fā)株提高了約84.71％，酸型槐糖脂產(chǎn)量達(dá)77 g/L，較出發(fā)株提高了1.48倍;在5-L發(fā)酵罐水平，其總槐糖脂產(chǎn)量可達(dá)135 g/L，較出發(fā)株產(chǎn)量提高一倍左右。
　　 出發(fā)株和5株高產(chǎn)菌株所產(chǎn)的總槐糖脂組成的HPLC分析表明，各突變株所產(chǎn)槐糖脂組成同出發(fā)株相同，但是，突變株的多數(shù)槐糖脂分子的峰面積較原菌株有較大提高，某些槐糖脂組分在總槐糖脂中所占的比例同野生株有較大變化，得到了內(nèi)酯型或者酸型槐糖脂比例增加的突變株，

5、而這些特定的高產(chǎn)菌株可以更好的應(yīng)用于不同的工業(yè)領(lǐng)域。
　　 2.新型槐糖脂的生產(chǎn)、分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
　　 槐糖脂的結(jié)構(gòu)會(huì)影響其理化活性和生物學(xué)活性。天然合成的槐糖脂脂肪酸部分通常是16C或18C，本工作旨在獲得脂肪酸部分碳鏈＞18 C或者為C18∶3的新型槐糖脂。
　　 分別以菜籽油、亞麻油和魚油為疏水性碳源發(fā)酵槐糖脂，得到了三種組分差異較大的槐糖脂混合物。利用制備型HPLC制備得到了這三種槐糖脂粗品中的主要組

6、分，并用MS、MS/MS和GC-MS分析了這幾種槐糖脂純品的結(jié)構(gòu)。以亞麻油為底物時(shí)，首次在W.domercqiae中得到了脂肪酸部分為C18∶3的雙乙酰化內(nèi)酯型槐糖脂，并且，該物質(zhì)的抗腫瘤活性未有報(bào)道。以富含長鏈脂肪酸的魚油為底物時(shí)得到了碳鏈長度大于18C的新型槐糖脂，包括:脂肪酸部分為C20∶5的，不含、含有一個(gè)或兩個(gè)乙?；乃嵝突碧侵?脂肪酸部分為C22∶6的雙乙酰化酸型槐糖脂;脂肪酸部分為C22∶3的無乙?；膬?nèi)酯型槐糖脂;脂肪酸

7、部分為C20∶0的無乙?；膬?nèi)酯型槐糖脂。這些新型槐糖脂可能會(huì)拓寬槐糖脂的應(yīng)用領(lǐng)域。
　　 3.槐糖脂脂肪酸部分結(jié)構(gòu)對其抗官頸癌活性影響、體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑和體內(nèi)抗宮頸癌活性的研究
　　 雖然之前的研究已經(jīng)證明了槐糖脂純品的乙酰化程度、脂肪酸部分的不飽和度及是否存在分子內(nèi)內(nèi)酯化等都會(huì)影響其抗腫瘤活性，脂肪酸的碳鏈長度和多不飽和度（雙鍵＞2）對槐糖脂抗腫瘤活性的影響還沒有被系統(tǒng)研究過。另外，槐糖脂引起細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路

8、也不清楚。目前，槐糖脂的抗腫瘤活性多限于體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)抗腫瘤活性報(bào)道非常少。
　　 選取6種雙乙酰化內(nèi)酯型槐糖脂分子，其脂肪酸部分分別為C18∶0，C18∶1，C18∶2，C18∶3，C16∶0和C16∶1，對這些槐糖脂分子對HeLa和CaSki細(xì)胞的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，槐糖脂的細(xì)胞毒性大小不僅受脂肪酸不飽和度影響，同時(shí)也受脂肪酸鏈長影響。研究脂肪酸鏈長對槐糖脂體外抗宮頸癌活性的影響發(fā)現(xiàn):碳鏈長度越長，槐糖脂的細(xì)胞毒性

9、越大。不同槐糖脂分子的細(xì)胞毒性應(yīng)該是脂肪酸不飽和度、碳鏈長度和槐糖部分乙?；餐饔玫慕Y(jié)果。
　　 對抗宮頸癌活性最好的脂肪酸部分為C18∶1的雙乙酰化內(nèi)酯型槐糖脂組分的體外抗宮頸癌機(jī)制進(jìn)行了深入研究，利用相差顯微鏡、電子顯微鏡及TUNEL等證明了該組分可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)，該槐糖脂作用后出現(xiàn)了明顯的二倍體亞峰，且多數(shù)細(xì)胞被阻滯在G0期，少部分細(xì)胞被阻滯在G2期。利用熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)

10、槐糖脂可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特異性蛋白CHOP和Bip蛋白的表達(dá)，而caspase-12和caspase-3也同樣被激活，說明槐糖脂可以通過ER應(yīng)激通路來誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。而對線粒體膜電位變化及胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量檢測發(fā)現(xiàn)，槐糖脂作用前后二者變化不大，說明線粒體通路可能沒有參與槐糖脂誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 建立了小鼠宮頸癌U14細(xì)胞的移植瘤模型，以研究槐糖脂的體內(nèi)抗宮頸癌活性，發(fā)現(xiàn)內(nèi)酯型槐糖脂粗品對人宮頸

11、癌裸鼠移植瘤有較好的抑制作用，低、中、高劑量的槐糖脂給藥組抑瘤率分別可以達(dá)到15.73％、26.40％和34.83％。并且，槐糖脂在體內(nèi)也可以誘導(dǎo)腫瘤組織發(fā)生細(xì)胞凋亡。
　　 4.主要酯酶/脂肪酶和單加氧酶在槐糖脂合成中的功能的初步研究
　　 目前，還沒有發(fā)現(xiàn)催化酸型槐糖脂分子形成內(nèi)酯的內(nèi)酯化酶。通常，催化合成內(nèi)酯的酶類可能為硫酯酶或者酯酶/脂肪酶及特定的單加氧酶。本工作利用W.domercqiae基因組注釋及該菌株在硫

12、酸銨和酵母粉兩種條件下基因表達(dá)水平的差異對可能完成催化內(nèi)酯化反應(yīng)的酯酶/脂肪酶及單加氧酶進(jìn)行了篩選，研究其在槐糖脂合成中的作用。
　　 首先，建立了W.domercqiae的遺傳操作系統(tǒng):確定潮霉素為抗性篩選標(biāo)記，甘油三磷酸脫氫酶的啟動(dòng)子Pgpd可作為外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子，電轉(zhuǎn)化的方法可以高效完成外源基因的導(dǎo)入。
　　 通過基因組及表達(dá)譜分析，選取了酵母粉條件下較硫酸銨條件下表達(dá)顯著上調(diào)的8個(gè)酯酶/脂肪酶基因及4個(gè)單加氧

13、酶，利用double-joint PCR的方法成功構(gòu)建了基因的敲除盒，對這12個(gè)基因進(jìn)行了成功敲除，并對其在槐糖脂合成過程中的功能進(jìn)行了初步分析。lipB基因可以影響多種槐糖脂組分的合成，△lipB敲除株槐糖脂產(chǎn)量較野生株大幅下降，當(dāng)以油酸為單一碳源時(shí)，△lipB敲除株無法檢測到槐糖脂產(chǎn)生。通過胞外蛋白分析及熒光定量PCR檢測槐糖脂合成過程中關(guān)鍵酶的表達(dá)情況，推測敲除株產(chǎn)量降低的原因包括兩個(gè)方面:菌株內(nèi)與槐糖脂合成相關(guān)的關(guān)鍵酶的表達(dá)量下

14、調(diào);胞外糖苷水解酶含量增加，可能通過水解槐糖脂的糖苷鍵而使槐糖脂產(chǎn)量下降。△moA敲除株所產(chǎn)酸型槐糖脂C18∶2 DASL在總槐糖脂中比例增加而內(nèi)酯型槐糖脂C18∶2 DLSL所占比例則有較大下降，推測moA基因的功能應(yīng)該是同脂肪酸部分為C18∶2的酸型槐糖脂的內(nèi)酯化相關(guān)。moD基因影響了C18∶2 NASL的乙?；Ｔ谝云咸烟呛投褂蜑榈孜飼r(shí)，同野生株相比，△lipD、△lipE、△lipF和△lipG敲除株發(fā)酵所得槐糖脂產(chǎn)量均有所降低

15、，槐糖脂中乙酰化程度較高的組分含量降低，而乙酰化程度相對較低的組分含量增加，推測這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是由于脂肪酶/酯酶的缺失使菌株將油脂水解為脂肪酸的能力下降，從而間接影響槐糖脂的合成，同時(shí)，脂肪酶可能也有催化槐糖脂乙?；墓δ?，它的缺失導(dǎo)致槐糖脂乙酰化程度降低;而當(dāng)以葡萄糖和油酸為底物時(shí)，由于油酸為單一脂肪酸，這幾個(gè)敲除株槐糖脂產(chǎn)量及組成無顯著變化。lipH基因同脂肪酸部分為C18∶2的酸型槐糖脂的內(nèi)酯化有一定關(guān)系，并且對菌株將C18∶1整

16、合入槐糖脂的過程也有一定影響。除moA和lipH基因同脂肪酸部分為C18∶2的酸型槐糖脂的內(nèi)酯化相關(guān)外，其它幾個(gè)基因的敲除多對槐糖脂內(nèi)酯化無顯著影響，推測菌體內(nèi)的內(nèi)酯化酶應(yīng)有多種。
　　 5.鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶在擬威克酵母中的異源表達(dá)
　　 為獲得具有更好的生物學(xué)活性或表面活性的槐糖脂分子，對槐糖脂的結(jié)構(gòu)修飾通常是通過化學(xué)法或酶催化法進(jìn)行，而本論文則成功構(gòu)建了鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶A和B基因（rhlA和rhlB）在W.domercq

17、iae中的表達(dá)載體，對W.domercqiae Y2A進(jìn)行遺傳改造，篩選得到了相應(yīng)的重組菌株Y2A-2，使其具有表達(dá)鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶1的能力。利用HPLC-MS的方法對重組菌株發(fā)酵的糖脂結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)組分（保留時(shí)間分別為16.74和17.47）的分子量分別為554(C26H50O12)和536(C26H48011)，前者可能為含1分子葡萄糖、1分子鼠李糖，脂肪酸部分為C14∶0的無乙?；乃嵝吞侵笳呖赡苁呛袃蓚€(gè)鼠李糖的、脂肪