O抗原合成過程中的5個(gè)糖基轉(zhuǎn)酶的供體特異性研究.pdf

1、位于脂多糖外側(cè)的O抗原影響細(xì)菌的致病性。負(fù)責(zé)合成O抗原的基因簇決定了O抗原的遺傳多樣性。O抗原基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶足負(fù)責(zé)將活性糖供體轉(zhuǎn)移到糖受體上的一類蛋白，可以特異地識(shí)別其供體和受體。自然界中存在成千上萬的糖基轉(zhuǎn)移酶，各自完成不同的功能。
　　 大腸桿菌中的很多菌株都可以引發(fā)腹瀉等疾病，沙門氏菌也是一種常見的致病菌，常引起各種食源性疾病的爆發(fā)。大腸桿菌和沙門氏菌具有相似的O抗原基因簇，親緣關(guān)系較近，很有可能起源自同一祖先。

2、r>　　 本研究中，對(duì)大腸桿菌O107和O117 O抗原合成過程中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因wclY的功能特異性進(jìn)行了研究，二者的受體相同(D-Gal)但供體不同，在O107中是D-GlcNAc，而在O117中是D-Glc。但是在O107和O117中，WclY只發(fā)生了3個(gè)氨基酸的替換，分別是W119G、C194R和D217N，而導(dǎo)致其供體的不同。因此，對(duì)這3個(gè)氨基酸分別進(jìn)行定點(diǎn)突變來研究其特異位點(diǎn)。
　　 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示O107 Wc

3、lY的第119位和第194位氨基酸的改變，其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的改變，與O117 WclY的二級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似;但第217位氨基酸的改變并沒有引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。因此，我們預(yù)測(cè)119位的甘氨酸和194位的半胱氨酸決定了O117 WclY糖基轉(zhuǎn)移酶供體特異性，對(duì)完成供體D-Glc的轉(zhuǎn)移起到了更為重要的作用。
　　 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和LPS電泳圖譜顯示，O107 WclY的第119位的色氨酸突變?yōu)楦拾彼嵋约?94位的半胱氨酸突變?yōu)榫彼釙r(shí)，

4、該突變體的功能類似于O117WclY，完成了對(duì)供體D-GlcNAc的轉(zhuǎn)移;但第217位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０窌r(shí)，無法完成對(duì)供體D-GlcNAc的轉(zhuǎn)移。這也就說明，第119位的甘氨酸和第194位的精氨酸對(duì)完成D-GlcNAc的轉(zhuǎn)移是極其重要的，笫217位的天冬酰胺并不影響其特異供體的轉(zhuǎn)移。
　　 推測(cè)大腸桿菌O112ac O抗原基因簇中具有類似于大腸桿菌O117 WclY功能的糖基轉(zhuǎn)移酶基因WfeK，但其與O117 WclY的氨

5、基酸序列相似性僅為34％。WfeK第194位的氨基酸為精氨酸，與O117 WclY相同，我們構(gòu)建了WfeK的克隆并定點(diǎn)突變WfeK第194位精氨酸為半胱氨酸來研究其功能。
　　 重組菌株的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和LPS電泳圖譜顯示，O112ac WfeK具有轉(zhuǎn)移D-GlcNAc至D-Gal的的功能。其194位的精氨酸突變?yōu)榘腚装彼釙r(shí)，失去了這種功能。這也進(jìn)一步說明了第194位精氨酸對(duì)WfeK的活性是非常必要的。
　　 分析沙門氏菌O

6、55和大腸桿菌O103的O抗原基因簇，發(fā)現(xiàn)一對(duì)類似于大腸桿菌O107和O117的wclY的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，在沙門氏菌O55中是wbdV,在大腸桿菌O103中是wbtF，這兩個(gè)基因的氨基酸序列相似性僅為47％。我們推測(cè)WbdV轉(zhuǎn)移D-Glcp到D-GalpNAc，而WbtF轉(zhuǎn)移D-GlcpNAc到D-GalpNAc。
　　 缺失沙門氏菌O55 wbdV后，回補(bǔ)wbdV和O103 wbtF。血清學(xué)分析和LPS電泳圖譜結(jié)果表明，wbd