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文檔簡介
1、背景和目的:侵襲性肺曲霉病是免疫受損宿主最常見的深部真菌感染,其發(fā)病率、死亡率居高不下,已對人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害,因此對其致病機(jī)制的探討具有重要意義。其主要病原菌煙曲霉孢子在被吸入肺泡后可誘發(fā)肺泡上皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排而內(nèi)化侵入上皮細(xì)胞,這是其逃避宿主巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞攻擊,造成后續(xù)侵襲性肺曲霉病發(fā)生發(fā)展的必要步驟。絲切蛋白(cofilin)是一類肌動(dòng)蛋白骨架解聚因子,其活性變化在一系列以細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排為基礎(chǔ)的重
2、要生命活動(dòng)中發(fā)揮調(diào)控作用。研究顯示cofilin在調(diào)節(jié)多種病原微生物侵染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用,如HIV病毒侵染CD4+T細(xì)胞,已成為抗感染藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)之一。本研究旨在研究cofilin在煙曲霉內(nèi)化侵入肺泡上皮細(xì)胞過程中的作用及所涉及的信號通路。
方法:1)應(yīng)用免疫熒光法觀察煙曲霉內(nèi)化侵入肺泡上皮細(xì)胞過程中肌動(dòng)蛋白骨架重排的情況及p-cofilin分布情況。2)應(yīng)用western blot法檢測煙曲霉孢子刺激A54
3、9細(xì)胞后cofilin/p-cofilin蛋白水平表達(dá)。3)應(yīng)用RT-PCR檢測煙曲霉膨脹孢子刺激A549細(xì)胞后cofilin轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。4)應(yīng)用制霉菌素保護(hù)法測定煙曲霉膨脹孢子對不同預(yù)處理的A549的內(nèi)化侵入率。
結(jié)果:1)煙曲霉膨脹孢子內(nèi)化侵入肺泡上皮細(xì)胞伴有肌動(dòng)蛋白骨架重排,侵入的孢子位于重排的骨架形成的吞噬小體內(nèi)。煙曲霉休眠孢子刺激A549細(xì)胞早期對細(xì)胞cofilin/p-cofilin蛋白水平表達(dá)無影響,一旦孢子膨
4、脹則可引起細(xì)胞早期p-cofilin蛋白水平表達(dá)動(dòng)態(tài)變化,呈先升后降,但對總cofilin蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)無影響,且增加的p-cofilin定位于肌動(dòng)蛋白骨架重排形成的吞噬小體上。2)A549細(xì)胞cofilin表達(dá)下調(diào)、上調(diào)或不能磷酸化均可減弱煙曲霉膨脹孢子的內(nèi)化侵入。A549細(xì)胞應(yīng)用LIM激酶抑制劑或過表達(dá)slingshot磷酸酶破壞cofilin/p-cofilin狀態(tài)也減弱煙曲霉膨脹孢子的內(nèi)化侵入。3)A549細(xì)胞RhoA活
5、性降低或ROCK活性降低均可通過減少細(xì)胞p-cofilin表達(dá)而減弱煙曲霉膨脹孢子的內(nèi)化侵入??扇苄驭?1,3-葡聚糖模擬煙曲霉膨脹孢子的刺激不能誘發(fā)A549細(xì)胞早期cofilin/p-cofilin動(dòng)態(tài)變化,且應(yīng)用dectin-1特異性抗體封閉細(xì)胞表面相應(yīng)受體也不能影響煙曲霉膨脹孢子引起的細(xì)胞早期p-cofilin蛋白水平表達(dá)變化。
結(jié)論:煙曲霉膨脹孢子感染肺泡上皮細(xì)胞可引起細(xì)胞早期cofilin/p-cofilin動(dòng)態(tài)變化
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