2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、煙曲霉是臨床重要條件性致病絲狀真菌之一,是引發(fā)人類曲霉病的主要菌種。煙曲霉主要感染免疫缺陷人群,其引起的侵襲性曲霉病有很高的死亡率,可達80-95%。近年來由于介入治療增多和免疫抑制劑的廣泛使用,免疫缺陷人群的數(shù)量在不斷增加,而另一方面不同國家和地區(qū)關(guān)于煙曲霉對目前臨床抗真菌治療的一線藥物,三唑類抗真菌藥物,包括伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑等的耐藥的報道,甚至是多重耐藥的報道在不斷增多,因此發(fā)現(xiàn)新的抗真菌治療靶點和解析煙曲霉耐藥機制成為

2、應(yīng)對煙曲霉感染的研究熱點。煙曲霉毒力是由多因素控制的,包括細胞壁組成成分、毒素、過敏原和蛋白酶等,宿主則通過第一道防線,固有免疫,吞噬和釋放炎性因子等抑制或清除煙曲霉。其中抵抗外界應(yīng)激和逃避宿主免疫的能力是影響煙曲霉毒力的關(guān)鍵因素。肌動蛋白骨架在真菌細胞極性生長、產(chǎn)孢、應(yīng)激和維持細胞形態(tài)等方面發(fā)揮重要作用,調(diào)控其功能的蛋白網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜,許多結(jié)合因子的功能亟待闡明。Cofilin(絲切蛋白)是一種肌動蛋白解聚因子,是肌動蛋白骨架重排的調(diào)控

3、核心之一。其可切割肌動蛋白纖絲,當(dāng)其N末端絲氨酸被磷酸化時,便失去切割活性。在哺乳動物細胞中,Cofilin參與許多生理功能,包括細胞運動、胞質(zhì)分裂、胞吞胞吐等。在釀酒酵母中,Cofilin是必需蛋白,其點突變影響菌株的生長表型和多重耐藥。而煙曲霉Cofilin的功能尚不清楚。因此,本論文的研究目的就是闡明Cofilin在煙曲霉不同生長階段的表達及其分布規(guī)律,并通過改變Cofilin蛋白的表達量、磷酸化狀態(tài)以及突變關(guān)鍵氨基酸位點探究了C

4、ofilin在煙曲霉生長、胞外應(yīng)激和毒力中的作用,最終通過這些系統(tǒng)性的研究,為抗真菌治療提供新的理論依據(jù)或可能的新靶點。
  首先,我們通過RT-qPCR方法確定了Cofilin在煙曲霉萌發(fā)階段(生長8 h時)表達最多。借助于熒光顯微鏡,我們對Cofilin蛋白融合GFP的菌株進行觀察,發(fā)現(xiàn)Cofilin蛋白彌漫的分布于胞質(zhì)中。根據(jù)同源重組原理和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法,我們構(gòu)建了以CEA17ku80Δ菌株為親本的cofilin條件性敲除

5、株(cofilinteton)、過表達株(cofilin OE)、cofilinS5A突變株和以cofilinteton為親本的cofilinS5E突變株(cofilinteton/cofilinS5E)。cofilinteton在低濃度多西環(huán)素(3μg/ml)存在時Cofilin的表達明顯低于親本菌株;而cofilin OE中的Cofilin表達量始終高于親本菌株。CofilinS5A突變后,Cofilin不能被磷酸化,模擬持續(xù)的激活

6、狀態(tài);CofilinS5E突變后,模擬Cofilin持續(xù)性磷酸化狀態(tài)。通過菌株生長實驗,我們發(fā)現(xiàn)Cofilin是煙曲霉的必需蛋白。Cofilin低表達導(dǎo)致煙曲霉在固體培養(yǎng)基上的生長速率明顯下降,菌絲的極性生長受到嚴重損害,菌落輻射狀生長消失;在液體培養(yǎng)基中cofilinteton生長初期常形成章魚樣結(jié)構(gòu),菌絲分支增多,而且出現(xiàn)胞質(zhì)泄露,而這種生長抑制很可能是胞質(zhì)泄露引起的,因為外源加入山梨醇可“拯救”cofilinteton的生長。Co

7、filin過表達對煙曲霉形態(tài)幾乎無影響,但在MM固體培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)時cofilin OE的生長速率會明顯高于親本菌株。煙曲霉在不同胞外應(yīng)激條件的生長實驗顯示,cofilinteton對熒光白、法尼醇、剛果紅敏感性與親本菌株相比無顯著差異,對SDS、H2O2和堿性pH9.0敏感性則顯著高于親本菌株;cofilin OE除了對H2O2的敏感性減弱之外,對其他應(yīng)激的敏感性與親本菌株基本無差異。進而,我們發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激基因(catA、ca

8、t1、skn7、yap1)和堿性pH的基因pacC在cofilinteton中表達下調(diào),在cofilin OE中表達上調(diào)。通過蛋白質(zhì)印跡實驗(Western blot),我們還發(fā)現(xiàn)Cofilin過表達激活了高滲透壓甘油應(yīng)激通路,p-SakA表達增多,同時SakA激活的3個標(biāo)記基因catA、dprA和dprB的mRNA表達也增多。
  通過體內(nèi)毒力實驗,我們發(fā)現(xiàn)cofilinteton感染的大蠟螟生存率顯著高于親本菌株,然而cofi

9、lin OE感染的大蠟螟和免疫缺陷小鼠(氫化可的松模型和環(huán)磷酰胺模型)的生存率與親本菌株感染的生存率無顯著差別,這提示Cofilin可能參與煙曲霉毒力的調(diào)節(jié)。接下來,我們通過體外實驗研究了Cofilin表達改變對煙曲霉與宿主細胞相互作用的影響,結(jié)果顯示cofilinteton和cofilin OE對肺上皮細胞A549的粘附能力都減弱,Cofilin低表達會引起煙曲霉粘附相關(guān)因子medA、stuA和uge3的下調(diào),而Cofilin過表達僅

10、引起stuA的下調(diào)。進而,采用制霉菌素保護實驗測定兩種菌株及親本菌株對肺上皮細胞A549細胞的侵染能力(即在宿主細胞內(nèi)的存活能力)發(fā)現(xiàn),Cofilin低表達使煙曲霉侵染A549細胞能力減弱,而Cofilin過表達使煙曲霉侵染A549細胞能力增強。再用3種菌株及它們的培養(yǎng)上清分別刺激A549細胞,通過RT-qPCR方法檢測細胞炎性因子MCP-1、IL-8和TNF-α表達水平,結(jié)果顯示:cofilinteton刺激時,A549細胞MCP-1

11、表達減少;cofilin OE刺激時,A549細胞MCP-1表達增多;但它們的培養(yǎng)上清刺激時,A549細胞MCP-1表達無變化。這說明Cofilin以某種方式影響了宿主細胞炎癥因子的釋放,而這種表達的改變可能與菌株表面的成分發(fā)生變化有關(guān),而與菌株外分泌的物質(zhì)關(guān)系不大。cofilin OE和親本菌株分別刺激用抗dectin-1抗體封閉的A549細胞,兩組細胞表達MCP-1無顯著差別。進一步,用免疫熒光方法標(biāo)記菌株表面多糖,發(fā)現(xiàn)cofili

12、n OE表面β-1,3-glucan和多糖共軛物增多,而cofilinteton表面β-1,3-glucan和多糖共軛物減少。這些結(jié)果提示cofilin OE刺激A549細胞MCP-1表達增多可能依賴菌株表面β-1,3-glucan的增多。由此,我們進一步用RT-qPCR方法對煙曲霉β-1,3-glucan合成酶和幾丁質(zhì)合成酶家族基因的表達水平進行檢測,結(jié)果顯示cofilinteton的這些基因的確表達下調(diào),cofilin OE中的這些

13、基因表達則上調(diào)。有趣的是,蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示Cofilin低表達顯著激活MpkA,使MpkA磷酸化顯著增多,而Cofilin過表達則不影響MpkA激活,這提示Cofilin的表達改變顯著影響了煙曲霉的極性生長、氧化和堿性 pH應(yīng)激以及毒力,這可能與Cofilin影響了煙曲霉胞壁多糖合成有關(guān),但這種Cofilin影響的煙曲霉胞壁多糖合成可能不依賴MpkA介導(dǎo)的細胞壁完整性信號通路的調(diào)控。
  緊接著,我們研究了Cofilin磷酸化

14、狀態(tài)改變(S5A和S5E突變)對煙曲霉菌株的影響。首先,CofilinS5A突變對煙曲霉形態(tài)和生長速率幾乎不影響;CofilinS5A突變后,煙曲霉對細胞壁干擾劑、H2O2和堿性pH的應(yīng)激敏感性無明顯變化;另外,cofilinS5A突變株與親本菌株對A549細胞的侵染能力和在氫化可的松免疫缺陷小鼠中的毒力都無顯著性差別。CofilinS5E突變會抑制菌株生長,如果Cofilin完全磷酸化,煙曲霉菌株無法存活;cofilinteton基礎(chǔ)

15、上的CofilinS5E突變(cofilinteton/cofilinS5E)并沒有加重cofilinteton在應(yīng)激方面的表型。這提示Cofilin的磷酸化狀態(tài)對煙曲霉生存與生長至關(guān)重要,過多非磷酸化Cofilin的存在對煙曲霉生理功能的影響可能不大,但具體機制仍需進一步研究分析。
  最后,為了更加深入研究煙曲霉Cofilin的功能,我們將Cofilin的多個可能重要功能位點進行了定點突變,并提出一種通過構(gòu)建母版基因突變cas

16、sette來實現(xiàn)基因突變的新策略。該策略簡單,不需要構(gòu)建質(zhì)粒,從而不需要酶切連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化和篩選,節(jié)省構(gòu)建時間,較適用于一次性構(gòu)建同一個基因多種突變菌株,而且是在基因組原位實現(xiàn)突變。通過該策略,我們構(gòu)建了3種cofilin突變株cofilinD21A,R21A,cofilinK36A和cofilinE48A,這些位點都是帶電荷的氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)cofilinD21A,R21A,cofilinK36A菌株與親本菌株比較,產(chǎn)孢減少,色素

17、增多。用熒光白染色菌絲,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)cofilinK36A菌絲顯著膨脹。通過成株實驗,我們發(fā)現(xiàn)cofilinD21A,R21A和cofilinK36A突變株對伏立康唑和伊曲康唑的敏感性顯著減弱,cofilinE48A突變株僅對伏立康唑的敏感性減弱。制霉菌素保護實驗則顯示,3種cofilin突變株對A549細胞侵染能力都顯著低于親本菌株。但是,3種突變株對氫化可的松免疫缺陷小鼠的毒力與親本菌株比較無顯著差別。這三種突變株調(diào)節(jié)耐藥性及侵

18、染能力的可能機制將在進一步研究中闡明。
  綜上所述,本論文研究較為系統(tǒng)地分析闡明了Cofilin在煙曲霉極性生長、抵抗應(yīng)激以及毒力等中的功能及可能的調(diào)控機制,在煙曲霉中發(fā)現(xiàn)了肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)蛋白與細胞壁應(yīng)激響應(yīng)機制及毒力間的聯(lián)系;鑒于煙曲霉Cofilin與人同源蛋白的親緣關(guān)系較遠,本研究也為抗真菌治療提供了新的理論依據(jù)和可能的藥物靶點。另外,我們的研究還建立了一種新的煙曲霉基因突變策略,為篩選煙曲霉重要蛋白的關(guān)鍵氨基酸和研究蛋白

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