農(nóng)藥降解菌施氏假單胞菌YC-YH1的分離鑒定及降解機(jī)理研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥的大量使用在消滅害蟲確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的同時(shí)，環(huán)境中殘留的農(nóng)藥給人類健康帶來許多危害。快速、有效的清除環(huán)境中的農(nóng)藥殘留已成為目前研究的熱點(diǎn)。從污染環(huán)境中分離篩選高效降解菌，利用微生物對(duì)殘留農(nóng)藥進(jìn)行生物降解，是修復(fù)農(nóng)藥污染環(huán)境的重要手段之一。
　　本研究從活性污泥中分離獲得一株毒死蜱高效降解菌YC-YH1，該菌株能夠利用毒死蜱為唯一磷源生長。通過顯微鏡和電鏡掃描觀察確定菌株YC-YH1的形態(tài)特征、結(jié)合Biolog微生物鑒定系統(tǒng)和

2、16S rRNA基因序列分子進(jìn)化分析，鑒定菌株YC-YH1為施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)。利用響應(yīng)面法研究菌株YC-YH1的最適降解條件，結(jié)果表明:菌株YC-YH1的最適降解條件為培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)基pH7.3，菌種的初始接種量12.0 mg/L，在優(yōu)化條件下培養(yǎng)4天，可將100 mg/L毒死蜱完全降解。在發(fā)酵條件下，菌株YC-YH1可耐受并降解高達(dá)400 mg/L的毒死蜱。降解底物譜分析發(fā)現(xiàn)，YC-YH1對(duì)

3、有機(jī)磷農(nóng)藥、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、多環(huán)芳烴化合物具有一定的降解能力。運(yùn)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)菌株YC-YH1在無磷培養(yǎng)基中降解毒死蜱所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和生物表面活性劑，推測(cè)出可能的代謝途徑和生物表面活性劑的組成成分。
　　本研究采用Illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)菌株YC-YH1的基因組進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。基因組測(cè)序分析表明菌株YC-YH1中同時(shí)含有有機(jī)磷降解酶基因mpd和ophC2，含有

4、編碼鞭毛、細(xì)菌趨化性所需的全部基因，同時(shí)含有萘、菲等物質(zhì)的降解途徑中部分所需酶的基因，這與菌株鑒定和降解特性研究結(jié)果相一致。菌株中含有較多的編碼分泌系統(tǒng)蛋白的基因和編碼生物膜組成蛋白的基因，具有特殊代謝能力和生物修復(fù)應(yīng)用潛力。這為研究菌株對(duì)外源化合物的代謝途徑及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了研究基礎(chǔ)。
　　熒光差異雙向凝膠電泳分析施氏假單胞菌YC-YH1在毒死蜱誘導(dǎo)條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，通過差異比較和統(tǒng)計(jì)分析，獲得377個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中11

5、3個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度上升，264個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度下降。在脅迫條件下，YC-YH1菌株中含有的有機(jī)磷降解酶MPH和OPHC2都是誘導(dǎo)性表達(dá)。選擇20個(gè)與農(nóng)藥脅迫相關(guān)蛋白的基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，檢驗(yàn)其在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況，驗(yàn)證結(jié)果表明其中有18個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與蛋白質(zhì)組結(jié)果相一致，另外2個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)相反。
　　從菌株YC-YH1的基因組中克隆到42個(gè)LysR型調(diào)控蛋白的編碼基因，并對(duì)這些蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化。利用Bia