熒光假單胞菌FD6抗生素合成調(diào)控基因的克隆及功能分析.pdf

1、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)FD6分離自福建省閩侯青口青菜根圍，對番茄灰霉病和桃褐腐病具有較好的防病效果。該菌株可以產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，如抗生素2，4-二乙酰基間苯三酚(2，4-diacetylphloroglucinol，2，4-DAPG，PHL)、硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin，PRN)和藤黃綠膿菌素(Pyoluterrin，PLT)等。前期的研究已證實這三種抗生素的生物合成受到GacS因子的正

2、調(diào)控。
　　RetS(Regulator of exopolysaccharide and typeⅢ secretion)是位于細胞膜上的感應(yīng)激酶，對多種基因的表達都有調(diào)控作用。本研究通過PCR法克隆得到FD6菌株中3767 bp的retS基因片段，利用同源重組進行基因缺失，通過功能互補分析retS基因?qū)D6生防相關(guān)性狀的影響。結(jié)果表明，retS基因缺失后抗生素PRN、2，4-DAPG和PLT的產(chǎn)量比野生型菌株FD6顯著升高，

3、分別是野生菌FD6的8.4倍、1.5倍和1.3倍，說明retS負調(diào)控抗生素PRN、2，4-DAPG和PLT生物合成。同時，retS基因在轉(zhuǎn)錄水平負調(diào)控prnA、phlA和pltA基因的轉(zhuǎn)錄。本研究還發(fā)現(xiàn)retS基因在轉(zhuǎn)錄水平負調(diào)控小RNA rsmX、 rsmY和rsmZ的轉(zhuǎn)錄表達。在retS基因和gacS基因雙缺失突變菌株中，抗生素PRN、2，4-DAPG和PLT合成量降低、小RNA轉(zhuǎn)錄表達及對病原真菌拮抗能力等性狀也降低，且與gacS

4、基因單缺失突變體的表型相似，說明retS基因?qū)股豍RN、2，4-DAPG和PLT生物合成的調(diào)控依賴于Gac/Rsm信號傳導(dǎo)途徑中的GacS蛋白。此外，還影響菌株FD6生長、游動性、生物膜的形成和定殖能力。以上結(jié)果表明，retS是影響FD6菌株生防能力的一個重要因子。
　　通過PCR法還克隆得到FD6菌株中2496 bp的vfr(Virulence factor regulator)基因，同樣方法構(gòu)建vfr基因內(nèi)缺失突變菌株FD

5、6Δvfr和互補菌株FD6-vfr，分析vfr基因?qū)D6生防相關(guān)性狀的影響。結(jié)果表明，vfr基因缺失后抗生素PRN、2，4-DAPG和PLT的合成量都顯著升高，分別是野生型菌株FD6的2.2倍、2.8倍和2.2倍，說明vfr基因也是抗生素生物合成的負調(diào)控因子。為了進一步探索vfr基因可能的調(diào)控機制，檢測了vfr基因在轉(zhuǎn)錄水平的影響，實驗結(jié)果表明，vfr基因?qū)股氐恼{(diào)控不依賴于Gac/Rsm，但明顯抑制rsmA、fleQ和rpoS的表