綠針假單胞菌GP72中吩嗪抗生素的合成基因簇克隆與產(chǎn)量提高.pdf

1、綠針假單胞菌GP72(PseudomonaschlororaphisGP72)是從上海郊區(qū)甜椒根際土壤中分離篩選得到的一株具有生物防治功能的假單胞菌,主要產(chǎn)生吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxilicacid,PCA)和2-羥基吩嗪(2-hydroxyphenazine,2-OH-PHZ),具廣譜抗菌活性,可以有效抑制一些植物病害的發(fā)生,但是野生型GP72的吩嗪抗生素產(chǎn)量相對(duì)較少。本課題首次確定了GP72產(chǎn)生吩嗪抗生素

2、的分子機(jī)理以及相關(guān)調(diào)控機(jī)理,并通過(guò)對(duì)GP72的調(diào)控基因的改造,使其產(chǎn)生抗生素的能力得到了提高,并且進(jìn)一步明確了2-OH-PHZ的生成轉(zhuǎn)化機(jī)制。首先,從與GP72親緣性相對(duì)較高的菌株的基因結(jié)構(gòu)入手,在基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,成功克隆出了GP72中的整個(gè)吩嗪相關(guān)基因合成簇,并且采用半隨機(jī)PCR的方法測(cè)得基因簇中上下游未知序列以查證整個(gè)基因簇的完整性。GP72的吩嗪相關(guān)基因合成簇一共包含10個(gè)基因,分別是群體感應(yīng)調(diào)控基因phzI和phzR,PC

3、A合成基因phzABCDEFG,以及2-OH-PHZ合成基因phzO。實(shí)驗(yàn)獲得12418bp的基因序列,為將來(lái)GP72的深入研究打下了扎實(shí)的基礎(chǔ)。其次,運(yùn)用分子生物學(xué)方法構(gòu)造了GP72中吩嗪抑制基因rpeA的突變菌株GP72AN,證明了rpeA基因的突變對(duì)于GP72中吩嗪類抗生素有一個(gè)明顯的促進(jìn)作用;并且在突變實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到了2-OH-PHZ合成的中間產(chǎn)物2-OH-PCA,明確了以PCA為前體,轉(zhuǎn)化生成2-OH-PCA,并最終產(chǎn)生2-OH

4、-PHZ的合成路徑。同時(shí),還構(gòu)建了phzO基因突變株GP72ON,以及rpeA、phzO雙突變株GP72ANON,實(shí)驗(yàn)表明GP72ON以及GP72ANON均不產(chǎn)生2-OH-PHZ以及2-OH-PCA,證明了phzO基因?qū)τ诜磻?yīng)的關(guān)鍵性的催化作用,進(jìn)一步明確了2-OH-PHZ的生成機(jī)制。最后利用基因突變菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),并通過(guò)發(fā)酵方法的一些改良,GP72中抗生素的產(chǎn)量獲得了很大的提升。野生型GP72的PCA產(chǎn)量從30ppm提升到了960p