深海鏈霉菌Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66中隱性次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的激活及其產(chǎn)物發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、海洋鏈霉菌是發(fā)現(xiàn)新型藥物先導(dǎo)物的重要源泉，然而研究表明其中許多隱性(cryptic)次級(jí)代謝生物合成基因簇在實(shí)驗(yàn)室條件下不表達(dá)或者表達(dá)量極低，從而極大阻礙了活性化合物的發(fā)現(xiàn)。本論文以深海鏈霉菌Streptomycessomaliensis SCSIO ZH66為研究對(duì)象，采用核糖體工程手段激活了其中編碼抗癌先導(dǎo)化合物FredericamycinA(FDMA)的隱性基因簇，進(jìn)一步通過發(fā)酵工程策略顯著提高了FDMA的產(chǎn)量，主要研究結(jié)果如下:

2、
　　通過核糖體工程手段獲得具有利福平抗性菌株7株，鏈霉素抗性菌株4株，從突變株中篩選得到了一株能夠抗利福平達(dá)到300μg/mL，在MS平板上培養(yǎng)積累棕色色素的突變株RIF1，其他抗性突變株和野生菌株并不積累;該色素化合物粗提取物具有良好的抗癌活性。通過篩選合適的發(fā)酵培養(yǎng)基，最終分離純化得到該化合物純品;通過分析比對(duì)1H-NMR、13C-NMR等數(shù)據(jù)，確定其為FDMA，表明在突變株RIF1中隱性FDM A合成基因簇被激活。

3、　　進(jìn)一步，本論文對(duì)突變株RIF1的rpoB基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明rpoB基因編碼的RNA聚合酶β亞基蛋白的第444位的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸。同時(shí)，對(duì)FDMA生物合成相關(guān)基因fdmD和fdmR1的表達(dá)情況進(jìn)行了分析;半定量RT-PCR結(jié)果表明在MS平板上培養(yǎng)3d時(shí)，在野生株和突變株中均為檢測(cè)到二者的表達(dá)，培養(yǎng)5d和7d后，二者在野生株中未見表達(dá)，而在突變株RIF1中均被激活;進(jìn)一步用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real time RT-PCR

4、)檢測(cè)了dmD和fdmR1基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果證明了與野生株相比，突變株RIF1中dmD基因和fdmR1基因均被激活，培養(yǎng)7d時(shí)突變株體內(nèi)fdmD基因和fdmR1基因轉(zhuǎn)錄水平比野生型菌株均提高了約15倍。
　　為了有效提高FDMA產(chǎn)量，通過單因素、PBD設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法BBD設(shè)計(jì)等手段對(duì)突變株RIF1產(chǎn)FDMA的發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的FDMA產(chǎn)量比原始條件下的產(chǎn)量提高了3倍，達(dá)到679.5mg/L。與已報(bào)導(dǎo)

5、的菌株相比，突變株RIF1的發(fā)酵周期較短和培養(yǎng)成本低廉，是一株良好的潛在FDMA生產(chǎn)菌株。
　　綜上所述，本研究利用核糖體工程手段對(duì)深海鏈霉菌S.somaliensis SCSIOZH66進(jìn)行抗性突變株的選育，從抗性穩(wěn)定的突變株中篩選得到隱性基因簇被激活，能夠產(chǎn)生抗癌活性化合物FDMA的突變株。進(jìn)一步結(jié)合發(fā)酵工程手段對(duì)FDMA發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，使其產(chǎn)量得到明顯提高。該核糖體工程及發(fā)酵工程相結(jié)合策略為在基因組信息指導(dǎo)下激活和提高隱