鏈霉菌分化負調節(jié)基因nsdA在抗生素高產育種上的應用.pdf

1、nsdA是該實驗室首次發(fā)現的一個全局性負調控基因,對天藍色鏈霉菌抗生素的合成和產孢形態(tài)分化具有負調節(jié)作用.nsdA的中斷菌株能夠提前且超量產生放線紫紅素、鈣依賴抗生素、次甲基霉素,同時產孢量也增多.該研究的目的是研究nsdA基因在其它鏈霉菌特別是重要抗生素產生菌中是否廣泛存在,并用于構建抗生素高產菌株.在該論文中,用天藍色鏈霉菌nsdA片斷為探針進行Southern雜交,在阿維鏈霉菌NRRL8165、吸水鏈霉菌5008、白色鏈霉菌JA3

2、453、金色鏈霉菌211、變鉛青鏈霉菌ZX64、鏈霉菌FR-008 DX600、吸水鏈霉菌10-22等7種鏈霉菌中都有雜交信號;并且PCR擴增都有明顯的特征帶.表明這些菌株中都含有nsdA的同源基因.變鉛青鏈霉菌含有沉默的放線紫紅素生物合成基因簇.對ZX64菌株的nsdA進行PCR擴增及序列測定,結果表明該基因與天藍色鏈霉菌A3(2)的nsdA有100﹪的核苷酸序列一致性.用基于同源重組的原理中斷ZX64的nsdA,抗性篩選獲得中斷菌株

3、WQ2,PCR實驗從分子水平上證明WQ2染色體中的nsdA已被中斷.與沉默的野生型菌株ZX64相比,WQ2能夠合成放線紫紅素;在WQ2中引入野生型nsdA,使互補菌株重新失去產抗生素能力.結果表明nsdA對變鉛青鏈霉菌抗生素合成具有負調節(jié)作用,中斷nsdA能激活沉默的抗生素生物合成基因.根據已測序的阿維鏈霉菌MA-4680菌株的序列設計引物,從阿維鏈霉菌NRRL8165中PCR擴增出包括nsdA同源基因nsdA<,av>及其兩側序列的5

4、.7kb的片段并測序驗證.接著構建了nsdA<,av>的中斷質粒pHL214,把該質粒接合轉移到阿維鏈霉菌NRRL8165中,篩選得到中斷菌株WQ5-1和WQ5-2,PCR驗證中斷菌株中nsdA<,av>基因已被正確中斷.對中斷菌株的發(fā)酵產物HPLC的分析表明中斷菌株阿維菌素的效價提高了大約3~5倍.根據天藍色鏈霉菌的序列設計引物,從吸水鏈霉菌5008中PCR擴增出包括nsdA同源基因nsdA<,jg>及其兩側序列的4.7kb的片段并測