檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)菌株黑曲霉的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本文對黑曲霉檸檬酸工業(yè)高產(chǎn)菌株發(fā)酵過程的胞內(nèi)胞外蛋白質(zhì)組進行了研究,旨在從蛋白表達的角度闡釋檸檬酸高產(chǎn)機理,為菌株改造提供依據(jù)。
　　采用實驗室5 L發(fā)酵罐模擬黑曲霉工業(yè)發(fā)酵過程,控制溶氧、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH等參數(shù),并對發(fā)酵過程中菌體形態(tài)變化、碳源消耗和有機酸分泌等情況進行監(jiān)測,確定了進行蛋白質(zhì)組分析的取樣點。胞內(nèi)蛋白取樣點為16 h,24 h,40 h,70 h,80 h和96 h;胞外蛋白取樣點為24 h,40 h,70 h,

2、96 h。
　　優(yōu)化黑曲霉蛋白質(zhì)提取過程,確定胞外蛋白沉淀劑選用含有0.07％β-巰基乙醇,10%TCA的預(yù)冷丙酮溶液(-20℃)。胞外蛋白提取緩沖液成分為Tris-HCl pH7.60.1 M,DTT0.1 M,cocktail片/10 mL,SDS1%。胞內(nèi)蛋白提取緩沖液成分為Tris-HCl pH7.60.1 M,DTT0.1 M,cocktail片/10 mL,SDS4%。優(yōu)化后的方法提取的蛋白濃度大,純度高,種類多,為蛋

3、白質(zhì)組檢測分析提供了高品質(zhì)樣品。
　　首次采用iTRAQ標記技術(shù)聯(lián)合LC-MS/MS對黑曲霉檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)菌株C0827發(fā)酵過程細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)組進行了定量分析。共鑒定出793組胞內(nèi)蛋白和55組胞外蛋白。檸檬酸合成和積累主要涉及中心碳代謝中糖酵解、三羧酸循環(huán)的一部分,相關(guān)途徑在快速產(chǎn)酸過程中被激活,參與其中的蛋白表達量上調(diào)。能量代謝相關(guān)蛋白上調(diào)。三羧酸循環(huán)其余部分、脂類代謝、氨基酸代謝、遺傳信息信息處理等途徑則有明顯下調(diào)。檸檬酸大量

4、積累,產(chǎn)酸減緩后,這些途徑又重新被激活。其中檸檬酸合成酶、順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶等表達量變化與產(chǎn)酸過程密切相關(guān),是檸檬酸生產(chǎn)過程的關(guān)鍵。菌體在不同發(fā)酵階段,分泌不同數(shù)量和種類的糖苷酶、酯酶和蛋白酶等,以適應(yīng)不同時期培養(yǎng)基中碳氮源存在形式的差異。
　　蛋白質(zhì)組實驗和發(fā)酵胞外產(chǎn)物分析均說明乙醛酸循環(huán)的存在。通過在檸檬酸發(fā)酵過程不同時間點添加油脂和衣康酸鹽探究乙醛酸循環(huán)在檸檬酸生產(chǎn)中的作用。發(fā)酵前期添加油脂影響呼吸,對菌體生長有一定