結(jié)核桿菌兩個毒力因子CFP-10和ESAT-6協(xié)同對宿主細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)長期寄生可以引起結(jié)核病。小分子分泌蛋白CFP-10和ESAT-6是結(jié)核分枝桿菌的毒力因子，在結(jié)核分枝桿菌感染和致病的過程中發(fā)揮了重要作用。在結(jié)核分枝桿菌感染宿主寄生于胞內(nèi)的過程中，結(jié)核分枝桿菌的兩個毒力因子CFP-10和ESAT-6在宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的機(jī)制仍不清楚。本課題組前期構(gòu)建了CFP-10-PEGFP-N1和ESAT-6-PEGFP-N1真核表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，初步觀察了兩個毒力因子單獨(dú)作用對宿主

2、細(xì)胞凋亡的影響。
　　目的：在前期研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了荷有紅色熒光報告基因的CFP-10-PDsRed1-N1，與荷有綠色熒光報告基因的ESAT-6-PEGFP-N1共同轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，獲得CFP-10基因和ESAT-6基因在同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞模型，進(jìn)而初步探討結(jié)核分枝桿菌毒力因子CFP-10、ESAT-6協(xié)同對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　方法：雙酶切CFP-10-PEGFP-N1真核重組表達(dá)質(zhì)粒

3、，獲得CFP-10基因片段，將CFP-10基因插入 PDsRed1-N1真核表達(dá)載體，構(gòu)建含有紅色熒光報告基因的CFP-10-PDsRed1-N1真核重組表達(dá)載體。按照以下分組形式：
　　1.PEGFP-N1組
　　2.PDsRed1-N1組
　　3.PEGFP-N1和PDsRed1-N1雙轉(zhuǎn)染組
　　4.CFP-10-PDsRed1-N1組
　　5.ESAT-6-PEGFP-N1組
　　6.CFP-

4、10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉(zhuǎn)染組
　　7.脂質(zhì)體組
　　8.空白對照組
　　采用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，通過倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞出現(xiàn)的熒光情況，用Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)CFP-10蛋白和ESAT-6蛋白的表達(dá)狀況，利用激光共聚焦顯微技術(shù)觀察分析轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中CFP-10蛋白和ESAT-6蛋白共定位的情況。用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測四個凋亡相關(guān)基因Bcl

5、-2、Bax、Caspase-8、Caspase-3在轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)表達(dá)情況。
　　結(jié)果：構(gòu)建獲得了序列正確的CFP10-PDsRed1-N1真核重組表達(dá)載體；獲得了結(jié)核分枝桿菌兩個毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因共同表達(dá)的真核細(xì)胞模型，通過倒置熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的293FT細(xì)胞能夠分別發(fā)出紅色熒光和綠色熒光；Western Blot檢測結(jié)果證實(shí)融合蛋白PDSRED-CFP-10和PEGFP-ESAT-6在

6、轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中獲得表達(dá)，通過激光共聚焦顯微技術(shù)觀察，又發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒 PEGFP-N1和PDsRed1-N1組293FT細(xì)胞的紅色熒光和綠色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)merge后在細(xì)胞的一部分區(qū)域的紅色熒光和綠色熒光疊加為黃色，另外一部分區(qū)域仍保持紅色熒光，提示紅色熒光與綠色熒光分布不完全一致；轉(zhuǎn)染 CFP10-PDsRed1-N1和ESAT6-PEGFP-N1組293FT細(xì)胞黃色熒光也分布于細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)merge后在胞質(zhì)中均為黃色，提示紅

7、色熒光與綠色熒光分布一致。采用熒光實(shí)時定量PCR檢測四個凋亡相關(guān)基因在轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)表達(dá)的結(jié)果顯示，CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24 h的Bcl-2基因的表達(dá)量比轉(zhuǎn)染后12 h增加幅度大，轉(zhuǎn)染后24 h的Bax基因的表達(dá)量比轉(zhuǎn)染后12 h增加幅度小，且Bax/Bcl-2比率變化呈下降趨勢，并在24 h降低幅度大。在CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEG

8、FP-N1雙轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24 h的Caspase-8基因表達(dá)量比轉(zhuǎn)染后12 h降低幅度大，與此同時，轉(zhuǎn)染后24 h的Caspase-3基因的相對表達(dá)量比轉(zhuǎn)染后12 h降低幅度大，且隨時間的增加，總體呈現(xiàn)降低的趨勢。
　　結(jié)論：獲得CFP-10-PDsRed1-N1真核重組表達(dá)載體能夠在真核細(xì)胞中正確表達(dá)，成功構(gòu)建了兩個毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因在同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞模型，CFP-10基因和ESAT-6基因

9、在同一個細(xì)胞內(nèi)表達(dá)互不干擾，其蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞中的分布是一致的，提示這兩個毒力因子在細(xì)胞內(nèi)可能是以復(fù)合物的形式存在和發(fā)揮作用。采用熒光實(shí)時定量PCR對各組細(xì)胞進(jìn)行凋亡相關(guān)基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CFP-10/ESAT-6復(fù)合物可能影響細(xì)胞內(nèi)的 Bax/Bcl-2比率，使之下降。CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉(zhuǎn)染組和 PEGFP-N1和 PDsRed1-N1雙轉(zhuǎn)染組 Caspase-8和Caspase-3基因