miRNA-155介導(dǎo)ESAT-6誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制及其在結(jié)核診斷中的作用.pdf

1、目的:
　　結(jié)核感染仍是世界公共衛(wèi)生難題，據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織(World HealthOrganization，WHO)統(tǒng)計(jì):2013年約有900萬新增活動(dòng)型結(jié)核病人，其中高達(dá)150萬人因結(jié)核病而喪命。近年來隨著多重耐藥結(jié)核、廣泛性耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)以及HIV-TB的合并感染，更加劇了目前結(jié)核病防控的嚴(yán)峻形勢。結(jié)核病的主要致病菌為結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），其主要潛伏感染人巨噬

2、細(xì)胞，并引起宿主細(xì)胞壞死裂解?？菇Y(jié)核免疫應(yīng)答是機(jī)體清除結(jié)核分枝桿菌的重要環(huán)節(jié)。除作為Mtb的主要感染細(xì)胞，巨噬細(xì)胞同樣也是機(jī)體殺死結(jié)核分枝桿菌的重要效應(yīng)細(xì)胞。已有研究表明:細(xì)胞凋亡在機(jī)體抗結(jié)核固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，Mtb減毒株或無毒株可促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，控制結(jié)核感染;然而Mtb強(qiáng)毒株可抑制凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，引起結(jié)核擴(kuò)散。結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6，作為結(jié)核分枝桿菌的重要毒力因子，在免疫調(diào)節(jié)中亦發(fā)揮重要作用。已有研究顯示:結(jié)核早

3、期分泌抗原ESAT-6能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，有利于機(jī)體清除結(jié)核分枝桿菌，但其相關(guān)分子機(jī)制并不十分清楚。
　　在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn):ESAT-6抗原刺激巨噬細(xì)胞后，能引起胞內(nèi)miR-155表達(dá)顯著升高，相關(guān)研究報(bào)道m(xù)iR-155參與了卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，通過生物信息學(xué)預(yù)測分析，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞信號抑制分子-1（suppressor of cytokine signal

4、ing-1，SOCS1）是miR-155的一個(gè)重要靶基因，且已有證據(jù)表明SOCSl可能是Mtb感染時(shí)巨噬細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號通路的一個(gè)關(guān)鍵分子，由此，我們推測miR-155與SOCS1相互作用可能參與了結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡過程。本研究擬在已有研究報(bào)道和我們前期工作基礎(chǔ)上開展如下工作:(1)明確結(jié)核抗原ESAT6處理巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-155、SOCS1的動(dòng)態(tài)變化和時(shí)間特異性;(2)應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染控制

5、miR-155及SOCS1表達(dá)，探討ESAT-6處理后，巨噬細(xì)胞中凋亡分子Caspase-3表達(dá)情況，明確miR-155及SOCS1在巨噬細(xì)胞凋亡中的作用;同時(shí)采用siRNA干擾技術(shù)控制Toll樣受體2(Toll-like receptor2，TLR2)及NF-κBp65表達(dá)，初步探討ESAT-6誘導(dǎo)miR-155表達(dá)上調(diào)的原因;(3)收集人外周血單個(gè)核細(xì)胞，熒光定量PCR檢測特定免疫分子及細(xì)胞因子表達(dá)情況，探討其在結(jié)核診斷中的作用。本

6、研究力圖為闡明ESAT-6在宿主免疫調(diào)節(jié)中的作用提供新的理論依據(jù)，同時(shí)亦為尋找新的結(jié)核病干預(yù)靶點(diǎn)及臨床結(jié)核病診治提供新的思路。
　　方法:
　　1.應(yīng)用結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6處理巨噬細(xì)胞系RAW264.7，收集經(jīng)處理后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總RNA及蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測胞內(nèi)miR-155、BIC、SOCS1、IL6及TNF-α及IFN-γ等mRNA表達(dá)水平; Western-blot技術(shù)檢測SOCS1、NF-κβ

7、p65及凋亡分子Caspase-3蛋白表達(dá)水平;同時(shí)，采用流式細(xì)胞儀檢測不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡發(fā)生情況;
　　2.采用慢病毒過表達(dá)miR-155及抑制miR-155，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測胞內(nèi)SOCS1、IL6及TNF-α mRNA表達(dá)變化;Western-blot技術(shù)檢測SOCS1及凋亡分子Caspase-3蛋白表達(dá)水平變化;并用流式細(xì)胞儀分析抑制miR-155后對細(xì)胞凋亡的影響;
　　3.采用慢病毒過表達(dá)SOCS1基因，

8、Westem-blot技術(shù)檢測凋亡分子Caspase-3蛋白表達(dá)水平;同時(shí)在過表達(dá)SOCS1的條件下，Western-blot技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)觀察miR-155對巨噬細(xì)胞凋亡的影響;
　　4.為了進(jìn)一步弄清楚ESAT-6誘導(dǎo)miR-155表達(dá)上調(diào)的主要原因，我們采用了siRNA干擾技術(shù)，控制RAW264.7細(xì)胞內(nèi)TLR2及NF-κB p65的表達(dá)，并用Western-blot技術(shù)觀察TLR2及NF-κB p65干擾效果，以及實(shí)時(shí)熒

9、光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)水平;
　　5.將研究人群分為三個(gè)組:正常對照組、活動(dòng)型結(jié)核組及潛伏型結(jié)核組。收集人外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測特定免疫分子(TLR2、BIC、miR-155、SOCS1)及細(xì)胞因子（TNFα、IL6、IL12p40、iNOS、IFN-γ）mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.ESAT-6處理巨噬細(xì)胞24h內(nèi)，細(xì)胞凋亡分子活性Caspase

10、-3表達(dá)不斷增加;流式細(xì)胞檢測結(jié)果亦表明ESAT-6能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡發(fā)生，并有時(shí)間依賴效應(yīng);此外，研究結(jié)果顯示miR-155、BIC及相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平隨ESAT-6處理時(shí)間不斷增加，而SOCS1表達(dá)水平隨時(shí)間增加而不斷下降;
　　2.單獨(dú)過表達(dá)miR-155能顯著抑制SOCS1表達(dá)，提高巨噬細(xì)胞凋亡分子CleavedCaspase-3表達(dá)，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡發(fā)生。采用慢病毒抑制miR-155表達(dá)，巨噬細(xì)胞內(nèi)SO

11、CS1表達(dá)明顯升高，而細(xì)胞因子如IL6，TNF-α等表達(dá)顯著減少，細(xì)胞凋亡受到明顯抑制;
　　3.過表達(dá)SOCS1基因可抑制ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡;而在過表達(dá)SOCS1條件下，過表達(dá)miR-155則可恢復(fù)Cleaved Caspase-3表達(dá)及大部分巨噬細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　4.成功構(gòu)建TLR2及NF-κB p65-siRNA干擾細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制TLR2表達(dá)能顯著降低ESAT-6介導(dǎo)的NF-κB p65表達(dá)，并干

12、擾細(xì)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)，提示TLR2/NF-κB活化可能是ESAT-6誘導(dǎo)miR-155表達(dá)上調(diào)的主要原因。
　　5.Q-PCR檢測人外周血單個(gè)核細(xì)胞中特定免疫調(diào)節(jié)分子（TLR2，BIC，miR-155及SOCS1）和細(xì)胞因子結(jié)果表明:TLR2，BIC，miR-155以及SOCS1在各組別中差異表達(dá)，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析提示miR-155/SOCS1比值可能區(qū)分活動(dòng)型結(jié)核及潛伏型結(jié)核感染。
　　結(jié)論:
　　1.miR-

13、155在ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫活化及凋亡過程中具有重要作用;
　　2.miR-155可能通過靶向作用SOCS1參與調(diào)控結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡發(fā)生;
　　3.ESAT-6誘導(dǎo)的miR-155表達(dá)上調(diào)與巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR2/NF-κB活化相關(guān);
　　4.TLR2，BIC，miR-155以及SOCS1或可作為結(jié)核病診斷的新型生物標(biāo)記分子。
　　綜上所述，TLR2/NF-κB/miR-155

14、/SOCS1信號參與了ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡過程，miR-155在ESAT-6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，這可能揭示了結(jié)核早期分泌抗原ESAT-6在宿主免疫調(diào)節(jié)作用中的新機(jī)制。同時(shí)，本研究提示TLR2/NF-κB/miR-155/SOCS1或可作為宿主免疫調(diào)節(jié)治療的重要靶標(biāo)，為結(jié)核治療研究增添了新的內(nèi)容;此外，人群研究提示TLR2，BIC，miR-155及SOCS1或可作為活動(dòng)型結(jié)核及潛伏型結(jié)核診斷的重要指標(biāo)，為結(jié)核病