FN-TPO基因修飾的間充質(zhì)干細胞對造血細胞擴增和造血重建的影響.pdf

1、背景：造血干/祖細胞(hematopoietic stern/progenitor cells，HSPC)移植是治療多種嚴重危害人類生命和健康的疾病的有效手段，而HSPC數(shù)量不足和骨髓造血誘導(dǎo)微環(huán)境(hematopoietic inductivemicro-environment，HIM)功能不全或遭到嚴重破壞是影響HSPC移植的主要因素。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中除HSPC外的另一種

2、干細胞，它是構(gòu)成骨髓HIM 的基質(zhì)細胞的主要來源。MSCs能夠效的支持造血細胞體外擴增，MSCs與HSPC共移植后可以恢復(fù)HIM，有利于促進造血重建；血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是一個有效的早期造血促進因子，纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是介導(dǎo)HSPC與HIM間相互作用的主要細胞外基質(zhì)成分之一，在骨髓中兩者均主要由MSCs發(fā)育而來的基質(zhì)細胞分泌。大量研究表明，通過基因修飾的方法可以改善MSCs的生物

3、學(xué)性狀。能否通過基因修飾的方法增強MSCs的造血支持能力，已經(jīng)逐漸成為研究的熱點。 目的：建立體外逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的骨髓MSCs纖維連接蛋白一血小板生成素(FN-FPO)基因修飾體系；觀察FN-TPO基因修飾的MSCs對造血細胞擴增和造血重建的影響。 方法：構(gòu)建攜帶 FN-TPO 基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體經(jīng)包裝細胞包裝后產(chǎn)生具有感染能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒，以其對骨髓MSCs進行基因修飾；RT-PCR檢測基因修飾后MS

4、Cs對FN-TPO基因的表達，臺盼蘭拒染法檢測基因修飾后骨髓MSCs的體外增殖能力，MTT法檢測基因修飾后MSCs黏附造血細胞能力，ELISA法檢測基因修飾后MSCs分泌TPO能力。將免疫磁珠分選的臍血CD34+細胞按照2.0×10<'4>/ml的細胞密度接種到基因修飾后骨髓MSCs形成的滋養(yǎng)層上并添加必要的細胞因子(SCF、FLT3-L、IL-11)擴增7 d，流式細胞儀檢測CD34+細胞擴增倍數(shù)，半固體培養(yǎng)基集落培養(yǎng)檢測擴增后細胞集

5、落形成能力。FN-TPO基因修飾后骨髓MSCs聯(lián)合臍血單個核細胞(mononuclear cells，MNCs)移植亞致死劑量放射線照射的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency disease，SCID)小鼠，觀察動物的一般情況、不同時間點外周血常規(guī)情況、移植4周后存活動物骨髓及外周血中人CD45+細胞含量和人beta-actin基因嵌合情況，判斷FN-TPO基因修飾后骨髓MSCs的造血重建能

6、力。 結(jié)果：成功構(gòu)建攜Fn-TPO基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體且以該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對骨髓MSCs進行體外基因修飾；RT-PCR法檢測到FN-TPO基因在骨髓MSCs內(nèi)能夠正常轉(zhuǎn)錄；基因修飾后的骨髓MSCs較未修飾細胞體外增殖能力無明顯改變[(6.92±0.77)×10<'4>/ml Vs(7.18±0.89)×10<'4>/ml，P>0.05]；黏附造血細胞能力增強(0.188±0.018 Vs 0.167±0.017，P<0.01

7、)，分泌TPO能力增強(7.46±0.59 ng/ml Vs 5.58±0.37 ng/ml，P<0.01)且不隨培養(yǎng)時間延長而顯著減弱(7.46±0.59 ng/ml Vs 7.15±0.19ng/ml，P>0.05)，但受細胞生長狀態(tài)影響。2.0×10<'4>臍血CD34+細胞經(jīng)基因修飾后骨髓MSCs聯(lián)合必要細胞因子體外擴增7d，有核細胞數(shù)、CD34+細胞比例、BFU-E、CFU-GM及CFU-GEMM分別為(29.9±2.7)×1

8、0<'4>、(33.3±2.8)％、109.3±4.1、163.7±7.1、13.3±1.5，較對照組明顯增加(P<0.01)。FN-TPO基因修飾后MSCs聯(lián)合臍血MNCs共移植能有效重建亞致死劑量放射線照射后的SCID小鼠造血，提高小鼠存活率。 結(jié)論： 1．成功建立了攜帶FN-TPO基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因修飾系統(tǒng)，并且成功對骨髓MSCs進行基因修飾； 2．FN-TPO基因修飾后MSCs黏附造血細胞、分泌TP