臍血干細胞移植重建免疫功能抑制人肝癌的實驗研究.pdf

1、近十余年來，造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)的適應(yīng)證在逐漸擴展，干細胞來源也在不斷增加。臍血移植(umbilical cord blood transplantation，LICBT)就是利用臍帶血中造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)重建造血免疫系統(tǒng)的一種HSCT療法。UCBT應(yīng)用于臨床是對以往廢棄的物質(zhì)有效的利用，也開辟了HSC

2、的另一來源。當前，HSCT臨床取得治療實效的疾病除十余種血液病外，還包括免疫缺陷病、遺傳性疾病、實體瘤等近20余種疾病。原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一，惡性度高，預(yù)后差，且發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重危害著人類健康。我國每年約23萬人死于肝癌，占全球肝癌患者死亡數(shù)的53％。其治療除了手術(shù)切除、介入導(dǎo)向、射頻、化療、放療外，免疫治療及其相關(guān)研究已日益受到重視。國內(nèi)外對肝癌的研究已使人認

3、識到，肝癌的生長、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)除了與肝癌細胞自身的生物學(xué)特性有關(guān)外，也與機體對肝腫瘤的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。而目前關(guān)于腫瘤與免疫研究的主要困難之一是缺乏有效實用的動物模型。嚴重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠是細胞免疫、體液免疫均缺陷的突變系鼠，是臍血移植及肝癌與免疫研究較為理想的實驗動物。 為進一步探討UCBT后免疫功能情況以及新建免疫對肝癌的影響，我們設(shè)計并進行了本項研究

4、。研究分兩部分：第一部分以人臍血造血干／祖細胞移植入SCID小鼠體內(nèi)建立人鼠嵌合模型，觀察臍血的移植潛能及重建免疫特征，并為下一步實驗打下基礎(chǔ)。第二部分在SCID鼠體內(nèi)建立的類似人體免疫系統(tǒng)環(huán)境內(nèi)，接種人肝癌細胞株，探討免疫細胞對肝癌移植瘤生長的影響，并研究其在肝癌負荷狀態(tài)下的免疫功能變化情況。為臨床合理有效地利用臍血干細胞對肝癌進行免疫治療提供依據(jù)。 第一部分嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠臍血移植后的免疫功能重建 目的：初步觀察

5、人臍血干／祖細胞在SCID鼠體內(nèi)的生長特性，免疫功能重建的時間與狀態(tài)。 方法：采集足月健康胎兒新鮮臍血，以6％HES+NH<,4>CL破紅細胞液法分離人臍帶血有核細胞，檢測有核細胞回收率及CD34<'+>細胞含量，立即使用或凍存?zhèn)溆?。SCID鼠21只，按隨機原則分為A、B、C三組，每組各7只。A組：臍血移植免疫功能重建、無腫瘤組；B組：臍血移植免疫功能重建、荷瘤組；C組：未重建免疫功能(免疫缺陷)、荷瘤組。A、B組分別經(jīng)尾靜脈程

6、序移植(分5次)，注入人臍血有核細胞(總量5×10<'7>)，兩組小鼠移植前都給予低劑量的環(huán)磷酰胺(150mg／kg)，并連續(xù)使用甲基強的松龍一周(自20mg／kg逐漸減量至5mg／kg)作為預(yù)處理。C組為未移植對照組。觀察各組小鼠存活情況，3周后A、B組每周斷尾或經(jīng)尾靜脈取血應(yīng)用流式細胞儀(Flow cytometry,FCM)及酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA法)檢測免疫功能重建情況，C組第三周、第六周各檢測一次免疫功能作為對照。

7、 結(jié)果:1．采用6％HES+NH<,4>CL，破紅細胞液分離法，有核細胞分離率81.6％，CD34<'+>細胞回收率70.9％，細菌培養(yǎng)(一)。 2．六周內(nèi)，臍血程序移植小鼠A組無死亡，B組于第一次移植后第12天死亡一只，尸檢無明顯GVHD征象。對照組C組于第26天死亡1只，死因不祥。三組死亡率比較P值均大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。 3．A、B組小鼠外周血于第四周時開始檢測到人源CD3<'+>細胞，至第六周時分別為A

8、組CD3<'+>(1.60±O.32)％，CD4<'+>／CD8<'+>2.36±0.74；B組CD3<'+>(1.56±0.30)％，CD4<'+>／CD8<'+>2.83±2.15。兩組比較P<,CD3>=0.842、P<,CD4／CD8>=0.654，均無統(tǒng)計學(xué)差異。小鼠血清中人源IgG于第三周時出現(xiàn)，至第六周時分別為A組(50.13±1.27)μg/ml， B組(48.12±3.89)μg/ml。兩組比較P=0.273，無統(tǒng)計

9、學(xué)差異。C組第三周、第六周時均未檢測到人源CD3<'+>細胞、人源IgG，與A組、B組比較P值均小于0.01，有顯著差異。 結(jié)論：6％HES+NH<,4>CL破紅細胞液分離法是一種成熟有效的分離方法，有核細胞分離率及CD34<'+>細胞回收率均較高，且終體積小，污染機會少，可在動物實驗研究中推廣應(yīng)用。人臍血程序移植加低劑量的環(huán)磷酰胺方案可替代照射預(yù)處理成功地在SCID鼠體內(nèi)建立類似人類免疫。 目的 證實臍血造血干／粗細胞

10、移植重建SCID鼠免疫對人肝癌有抑制及殺傷作用并探討其免疫學(xué)機制是否為負荷人腫瘤激活人源性免疫功能。 方法 首先進行人肝癌高轉(zhuǎn)移細胞株HCCLM<,6>細胞培養(yǎng)，然后以HCCLM<,6>細胞株分別在臍血移植免疫功能重建組(B組)及未移植臍血造血干／祖細胞組(C組)建立SCID鼠皮下荷瘤模型，臍血移植免疫功能重建A組作為對照組。實驗動物于接種腫瘤后5周處死，分別進行以下檢測：1．比較B、C兩組之間腫瘤生長情況的差異。2．比較B、

11、A兩組之間免疫功能指標變化情況，即用流式細胞儀分析小鼠外周血有核細胞中人淋巴細胞比例，ELISA法測定人IgG含量。3．比較A組第6周與第11周時免疫功能指標變化情況。4．常規(guī)病理學(xué)檢查：比較B、C兩組移植瘤狀況，并觀察有無腫瘤轉(zhuǎn)移。5．免疫組化檢查：觀察B組腫瘤組織中人源CD3<'+>、CD8<'+>細胞對腫瘤組織的殺傷。5．細胞毒試驗：B、C兩組動物脾臟細胞與HCCLM6細胞體外混合培養(yǎng)，采用MTT法觀察對腫瘤細胞的殺傷作用。

12、 結(jié)果 1．HCCLM<,6>增殖速度快，倍增時間短，為32.8小時。 2．HCCLM<,6>細胞株接種于免疫功能重建組(B組)及未重建組(C組)SCID小鼠皮下均可成瘤，成瘤率為100％，成瘤潛伏期分別為(9.83±1.47)d、(5.16±1.17)d，二組比較P<0.01；接種后5周移植瘤體積分別為(539.22±94.08)mm3、(1126.17±154.75)mm3，二組比較P<0.01；均有統(tǒng)計學(xué)差異。

13、 3．免疫功能重建荷瘤組(B組)接種后5周與免疫功能重建無腫瘤組(A組)SCID小鼠外周血有核細胞中人淋巴細胞比例CD3<'+>，CD4<'+>／CD8<'+>分別為B組：(2.17±0.50)％、1.19±0.66；A組(1.50±0.40)％、2.17±0.88，二組比較，P<,CD3>=0.04、P<,CD4／CD8>=0.08。人IgG含量分別為(61.68±5.66)ug/ml、(48.57±4.51)u g／ml，二

14、組比較P，CD4<'+>／CD8<'+>及人IgG含量第6周與第11周時分別為(1.60±0.32)％、2.36±0.74、(50.13±1.27)μg/m1與(1.50±0.40)％、2.17±0.88、(48.57±4.51)μg/m1，可以看出T淋巴細胞在第6周時已達高峰并可維持到第11周尚無明顯變化，而IgG含量雖有所下降，但并無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)

15、。 5．病理學(xué)檢查可見：B組腫瘤壞死明顯，未見遠處轉(zhuǎn)移；C組壞死程度明顯較輕，可見肺轉(zhuǎn)移。 6．免疫組織化學(xué)檢查：B組腫瘤組織中可見大量人源CD3<'+>，CD8<'+>細胞浸潤，壞死組織周圍更加明顯。C組移植瘤內(nèi)亦有腫瘤壞死，但未見人源淋巴細胞。 7．細胞毒試驗表明：B組脾臟細胞對HCCLM<,6>細胞的殺傷作用明顯，在效靶比例為120：1時，特異性殺傷率為(7.41±1.07)％、，C組脾細胞對肝癌細胞的殺傷