人外周血淋巴細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)后細(xì)胞表型變化及生物學(xué)活性的研究.pdf

1、第一部分： 目的：建立一種高效、簡(jiǎn)便的體外擴(kuò)增培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞的方法。 方法：取35例惡性腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，在GMP實(shí)驗(yàn)室體系下，應(yīng)用OKM-100及OKM-200培養(yǎng)基，經(jīng)細(xì)胞刺激因子OKM-24體外誘導(dǎo)擴(kuò)增，觀察效應(yīng)細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)周期、擴(kuò)增前后細(xì)胞總數(shù)、擴(kuò)增倍數(shù)以及細(xì)胞存活率，同時(shí)觀察細(xì)胞回輸患者后的不良反應(yīng)。 結(jié)果：細(xì)胞在培養(yǎng)的第2天即可觀察到效應(yīng)細(xì)胞增殖；細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)周期為1

2、3.46±1.20d；擴(kuò)增培養(yǎng)前外周血分離所得的PBMCs細(xì)胞數(shù)為6.60±2.23×106，擴(kuò)增培養(yǎng)至細(xì)胞成熟收獲后所得的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)為2.99±0.65×109，擴(kuò)增倍數(shù)為488.06±191.25；臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率為97.71±1.07％；內(nèi)毒素及細(xì)菌、真菌、支原體、外來(lái)病毒檢測(cè)均為陰性。患者回輸效應(yīng)細(xì)胞后無(wú)明顯的不良反應(yīng)。 結(jié)論：在本研究體系下體外誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)腫瘤患者自體外周血致敏淋巴細(xì)胞效率較高，操作簡(jiǎn)便，生物安

3、全性良好。 第二部分人外周血淋巴細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞表型變化研究 目的：觀察35例惡性腫瘤病人外周血淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后細(xì)胞表型的變化。 方法：體外大規(guī)模誘導(dǎo)和擴(kuò)增惡性腫瘤病人外周血淋巴細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞，然后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定擴(kuò)增前后CD3+、CD19+、CD28+、CD25+、CD29+、CD45RA+、CD45RO+、HLA-DR+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16-CD56+

4、、CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56+、CD4+CD25+、CD4+CD29+、CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD45RA+、CD8+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+，CD3+HLA-DR+，CD3+HLA-DR-，CD4+HLA-DR+，CD4+HLA-DR+、CD4+HLA-

5、DR+、CD4+HLA-DR-細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中所占百分比的變化。 結(jié)果：經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，CD3+，CD3+CD8+，CIK(cytokine-inducedkillercells)細(xì)胞及其亞型CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56+、CD3+CD16+CD56+，CD45RO+細(xì)胞及其亞型CD8+CD45RO+，CD8+CD28+，CD25+，CD29+，CD3+HLA-DR-，CD8+HLA-DR+和CD8

6、+HLA-DR-細(xì)胞比例較培養(yǎng)前明顯增加(P＜0.01)；而CD19+，CD3+CD4+，NK(naturalkillercells)細(xì)胞及其亞型CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56-、CD3-CD16+CD56+，CD45RA+細(xì)胞及其亞型CD4+CD45RA+、CD8+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD28+細(xì)胞及其亞型CD8+CD28+，CD4+CD25+，CD4+CD29+，CD4+HLA-DR+和

7、CD4+HLA-DR-細(xì)胞比例則明顯的降低(P＜0.01)；HLA-DR+細(xì)胞和CD3+HLA-DR+細(xì)胞培養(yǎng)前后細(xì)胞比例變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.137和0.423)。 結(jié)論：經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，所得細(xì)胞主要是以CD3+細(xì)胞為主，CD4+T細(xì)胞比例明顯下降，CD8+T細(xì)胞比例顯著增高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞的比例極低，活化性T細(xì)胞的比例與培養(yǎng)前無(wú)顯著差異。在增多的CD8+T細(xì)胞中，效應(yīng)性T細(xì)胞(TE

8、)并未明顯增加，但記憶性T細(xì)胞(TM)卻顯著增多。NK細(xì)胞比例下降，但CIK細(xì)胞的比例卻明顯增多。從對(duì)培養(yǎng)后細(xì)胞表型的分析可知，理論上，培養(yǎng)后細(xì)胞不僅具有直接的殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，回輸患者體內(nèi)后經(jīng)抗原刺激后還具有活化為效應(yīng)細(xì)胞的能力。 第三部分人外周血淋巴細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)后效應(yīng)細(xì)胞生物 方法：①按照本課題第一部分中的方法體外擴(kuò)增3例惡性腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞，收獲細(xì)胞后計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞濃度，然后將效應(yīng)細(xì)胞分別放置于4℃

9、和25℃下保存，于細(xì)胞收獲后的不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用碘化丙啶(PI)對(duì)兩種存放條件下的細(xì)胞進(jìn)行染色并應(yīng)用流式細(xì)胞儀器檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞存活率；②按照本課題第一部分中的方法體外擴(kuò)增3例患者外周血淋巴細(xì)胞，按照本課題第二部分中的方法檢測(cè)擴(kuò)增后細(xì)胞中NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞的百分比，然后應(yīng)用MTT法檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。 結(jié)果：①患者1效應(yīng)細(xì)胞初始存活率為98.8％，細(xì)胞濃度為7.4×107/mL，在4℃保存條件下其存活率明顯降低的時(shí)間點(diǎn)為102h

10、，而在25℃保存條件下其存活率明顯下降的時(shí)間點(diǎn)為48h；患者2效應(yīng)細(xì)胞初始存活率為95.5％，細(xì)胞濃度為5.8×107/mL，在4℃保存條件下其存活率明顯下降的時(shí)間點(diǎn)為60h，在25℃保存條件下其存活率明顯降低的時(shí)間點(diǎn)為24h；患者3效應(yīng)細(xì)胞初始存活率為97.1％，細(xì)胞濃度10.4×107/mL，在4℃保存條件下其存活率明顯降低的時(shí)間點(diǎn)為84h，在25℃保存條件下其存活率明顯下降的時(shí)間點(diǎn)為24h。②患者1效應(yīng)細(xì)胞中NK細(xì)胞的百分比為2.

11、4％，CIK細(xì)胞的百分比為53.9％，其12：1、25：1和50：1三個(gè)效靶比效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的殺傷率分別為64.9％、70.8％和83.4％；患者2效應(yīng)細(xì)胞中NK細(xì)胞的百分比為0.6％，CIK細(xì)胞的百分比為69.5％，其12：1、25：1和50：1三個(gè)效靶比效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的殺傷率分別為71.6％、75.1％和88.6％；患者3效應(yīng)細(xì)胞中NK細(xì)胞的百分比為11.6％，CIK細(xì)胞的百分比為41.7％，其12：1、25：1和50：