鈷納米顆粒對外周血T淋巴細胞生物學效應及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 現(xiàn)代金屬-金屬(MOM)人工髖關節(jié)置換系統(tǒng)提高了假體的耐磨性和抗疲勞強度，在臨床上表現(xiàn)出優(yōu)良的早中期效果。作為植入材料，不可避免地面對機械物理、電化學腐蝕等多種因素造成的降解，形成具有化學活性的產物。大量研究表明，MOM術后患者血液、尿液中鈷、鉻離子濃度顯著升高。值得一提的是，假體周圍組織中發(fā)現(xiàn)超細直徑的金屬顆粒（6-834nm），主要是含鈷基的納米顆粒。病例研究顯示，部分翻修假體周圍出現(xiàn)廣泛滑膜潰瘍伴淋巴細胞

2、、漿細胞浸潤：“炎性假瘤”形成—含有血管、壞死組織及多核巨細胞的肉芽腫樣改變，且金屬磨屑沉淀其中，局部淋巴結凝固性壞死。同時，假體植入時間的延長伴隨外周血淋巴細胞染色體易位率和染色體非整倍體率提高，T細胞、白細胞和骨髓細胞水平下降；部分患者血清中發(fā)現(xiàn)鈷、鉻特異性IgE。體外研究表明，金屬納米顆粒自身尺寸效應帶來了有別于宏觀粒子及相應離子的生物學效應。因此，探討鈷納米顆粒(CoNPs)對機體免疫系統(tǒng)的生物學效應及其機制具有重要意義。

3、>　　 第一部分鈷納米顆粒對外周血T淋巴細胞的細胞毒性和遺傳毒性作用
　　 目的：
　　 研究鈷納米顆粒(CoNPs)對外周血T淋巴細胞的細胞毒性和遺傳毒性作用，同時以鈷離子(Co2+)作為比較研究，初步探討MOM術后一系列復雜生物學反應的病因。
　　 方法：
　　 以正常外周血T淋巴細胞作為試驗系統(tǒng)，采用不同濃度的CoNPs和Co2+對細胞進行處理，在不同時間點利用3-(4,5-二甲基噻唑－2)－2,

4、5-二苯基四氦唑溴鹽(MTT)及乳酸脫氫酶(LDH)分析方法檢測細胞生存率，利用彗星試驗(Comet assay)及微核試驗(MNT)檢測細胞DNA和染色體損傷，評估CoNPs和Co2+的細胞毒性和遺傳毒性。同時，使用ICP-MS(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)檢測手段，評估CoNPs細胞外釋放離子的情況。
　　 結果：
　　 (1)CoNPs及Co2+對外周血

5、T淋巴細胞的細胞毒性效應呈現(xiàn)時間、濃度依賴性。
　　 (2)CoNPs、Co2+細胞毒性起效濃度分別約為10、50μM,4hCC50分別為10、50μM，說明CoNPs的細胞毒性效應強于Co2+。
　　 (3)50、100μMCoNPs在4、24、48h釋放(％)分別為5.12±1.44、14.22±3.17、32.78±2.70及6.27±2.49、18.78±4.29、38.81±2.11，隨著時間的延長離子釋放逐步

6、增加，呈現(xiàn)時間依賴關系（P＜0.001）。各時間點釋放的濃度均小于Co2+細胞毒性起效濃度(50μM)，提示CoNPs的細胞毒性作用并不依賴于細胞外Co2+釋放。
　　 (4)LDH實驗結果和MTT吻合。
　　 (5)CoNPs在3、6μM劑量，尾部DNA含量分別為8.73±4.60、9.64±4.77，Olive尾矩分別為2.16±1.19、9.66±4.73與溶劑對照組尾部DNA含量（1.46±0.76）和Olive

7、尾矩（0.35±0.21）相比均有顯著差異(P＜0.01);Co2+各劑量組尾部DNA含量和Olive尾矩與溶劑對照組相比均無顯著差異(P＞0.05)。結果說明，CoNPs可以引起外周血T淋巴細胞DNA鏈斷裂，導致初始DNA損傷；本研究設計的濃度及染毒時間內，未發(fā)現(xiàn)Co2+造成T淋巴細胞DNA損傷。
　　 (6)CoNPs在6μM劑量，微核率(BNMN(‰))為13.69±1.85，與對照組(5.46±1.28)相比有顯著差異(

8、P＜0.05);Co2+各劑量組微核率與對照組相比均無顯著差異(P＞0.05)。說明CoNPs可以引起外周血T淋巴細胞染色體損傷；本研究設計的濃度及染毒時間內，未發(fā)現(xiàn)Co2+造成T淋巴細胞染色體損傷。
　　 結論：
　　 (1)CoNPs可以對人免疫細胞產生細胞毒性及潛在遺傳毒性作用，可能是通過自身特殊動力學行為介導，不依賴于細胞外Co2+釋放，且毒性作用強于Co2+。
　　 (2)試驗結果部分解釋了MOM術后假

9、體周圍炎性假瘤形成、外周血免疫細胞減少及染色體畸變的原因。
　　 (3)本研究無法排除CoNPs和Co2+是否存在協(xié)同效應，有待后續(xù)深入探討。
　　 第二部分鈷納米顆粒對外周血T淋巴細胞生物學效應機制的研究
　　 目的：
　　 研究CoNPs的表征特性、介質中分散情況、是否能進入細胞、細胞處理后的氧化應激水平，初步探討CoNPs生物學效應的機制。
　　 方法：
　　 以PBS及含血清培養(yǎng)基

10、作為溶劑，利用TEM觀測CoNPs分散情況，同時檢測CoNPs的粒徑分布。細胞經過CoNPs處理后固定、脫水、浸、包埋、切片、染色，借助TEM觀測CoNPs進入細胞的情況。CoNPs和Co2+分別對細胞進行染毒，采用熒光分光法檢測細胞內活性氧(ROS)水平、谷胱甘肽還原酶法檢測還原型谷胱甘肽(GSH)水平、鄰苯二酚氧化法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力、H2o2還原法檢測過氧化氫酶(CAT)活力、GSH氧化法檢測谷胱甘肽過氧化物酶(GP

11、x)活力。
　　 結果：
　　 (1)CoNPs在不同的溶劑中解聚情況有所區(qū)別：5%人AB血清RPMI-1640培養(yǎng)液為溶劑時解聚效果優(yōu)于PBS溶劑；同時，CoNPs的粒徑分布平均為50nm。
　　 (2)細胞胞漿中出現(xiàn)致密CoNPs團塊，外形上類似一整體的大尺寸顆粒，其電子密度高于細胞質，細胞膜未見破壞，細胞核未見CoNPs積聚。
　　 (3)相比較對照組，CoNPs處理組相對熒光單位(RUF)升高具有

12、統(tǒng)計學意義（P＜0.05），間接說明CoNPs可以導致T淋巴細胞內ROS明顯升高，自由基蓄積；Co2+處理組RUF升高無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 (4)CoNPs處理組GSH值8.74±2.41μM/mg protein，相比較對照組GSH值15.27±1.32μM/mg protein，差異顯著(P＜0.05)；Co2+處理組GSH值13.62±0.85μM/mg protein，無顯著差異（P＞0.05）。說明Co

13、NPs可以導致T淋巴細胞內GSH明顯下降，細胞處于氧化應激狀態(tài)。
　　 (5)CoNPs處理組SOD、CAT、GPx水平分別為8.92±0.57、6.33±0.46、6.15±0.64U/mg protein，相比較對照組12.46±1.02(SOD)、11.21±0.60(CAT)、11.87±0.89(GPx)U/mg protein，差異顯著(P＜0.05);Co2+處理組SOD、CAT、GPx水平分別為10.71±0.4

14、8、10.11±0.61、11.03±1.29U/mg protein，無統(tǒng)計學差異(P＞0．05)。
　　 結論：
　　 (1)CoNPs血清懸浮體系穩(wěn)定性較高，有利于機體內血液、淋巴液轉運及生物學效應作用。
　　 (2)CoNPs可以高效便捷地進入T淋巴細胞，而不依賴細胞的吞噬功能。
　　 (3)CoNPs可引起外周血T淋巴細胞內ROS蓄積，同時破壞細胞抗氧化防御機制，導致自由基的產生與清除處在失衡狀