CD45RA陽性細(xì)胞去除后的外周血干細(xì)胞產(chǎn)物體外生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的：
　　探索異基因造血干細(xì)胞移植后不引起移植物抗宿主病（GVHD）的安全有效的細(xì)胞過繼免疫治療方法；研究證實(shí)處女淋巴細(xì)胞（ Naive T，人類表達(dá)CD45RA+）是引起aGVHD的主要效應(yīng)細(xì)胞，驗(yàn)證體外利用CD45RA免疫磁珠去除供者外周血干細(xì)胞中CD45RA+細(xì)胞的可行性；檢驗(yàn)去除處女淋巴細(xì)胞同時(shí)其他被去除的細(xì)胞成分；比較去除CD45RA+細(xì)胞前后的供者外周血干細(xì)胞產(chǎn)物其體外抗血液系統(tǒng)腫瘤、抗CMV/EBV/曲霉菌病原體以

2、及與患者自身細(xì)胞反應(yīng)的活性有無差異。
　　方法：
　　CD45RA免疫磁珠分選供者外周血干細(xì)胞中的CD45RA+細(xì)胞；分選前后細(xì)胞產(chǎn)物分別流式細(xì)胞儀檢測CD34+及T/B/NK/CD45RA/CD45RO細(xì)胞比例；分選前后細(xì)胞產(chǎn)物分別做造血干細(xì)胞集落培養(yǎng)；分選前后細(xì)胞產(chǎn)物與不同腫瘤株共培養(yǎng)，CCK-8檢測其體外抗腫瘤活性；供受者混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，CCK-8檢測其體外同種異體反應(yīng)；EBV、CMV及曲霉特異性抗原刺激分選前后細(xì)胞

3、，流式檢測其IFN-γ分泌水平，同時(shí)，ELISA檢測刺激前后細(xì)胞上清液中IFN-γ水平。
　　結(jié)果：
　　1.病例資料：共10例，均為我科單倍體造血干細(xì)胞移植健康供者，經(jīng)G-CSF刺激后血細(xì)胞分離機(jī)分離外周血干細(xì)胞，其中女性1例，男性9例，中位年齡33歲（18-54歲），常規(guī)檢查血清EBV/CMV，其中一例供者EBV陽性，其余供者EBV及CMV均為陰性。
　　2.利用CD45RA免疫磁珠分選供者PBSCs中的CD45R

4、A+細(xì)胞有效率達(dá)95.41％(88.21%-98.18%），目標(biāo)產(chǎn)物中CD45RA+細(xì)胞平均2.27%（0.11%-5.06%）。因此，體外利用CD45RA免疫磁珠分選PBSCs中CD45RA+細(xì)胞是安全有效的。
　　3.分選前后細(xì)胞成分比較：分選前CD34+平均3.6%（2.45%-4.32%），CD3+細(xì)胞平均66.21%（53.5%-81.4%），CD3+CD4+平均33.7%(25.4%-43%)，CD3+CD8+平均25

5、.82%(15.8%-33.2%)，CD3-CD19+平均17.65%（7.8%-29%），CD3-CD16/56+平均11.96%（3.7%-26.9%）。分選后CD34+平均2.09%（1.78%-2.34%）， CD3+細(xì)胞平均66.31%（53.5%-81.4%），CD3+CD4+平均46.1%(16.01%-76.94%), CD3+CD8+平均14.9%(7.16%-37.62%)，CD3-CD19+平均0.29%（0%-0

6、.75%）,C D3-CD16/56+平均6.9%（0.1%-13.87%），CD45RA+平均2.27%（0.11%-5.06%），其中分選后CD34+、CD3+CD8+、CD3-CD19+細(xì)胞減少，與分選前比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。
　　4.分選前后細(xì)胞產(chǎn)物造血干細(xì)胞集落培養(yǎng)：分選前BFU-E平均82.6個(gè)（59個(gè)-134個(gè)），CFU-GM平均39.8個(gè)（25-56個(gè)），CFU-GEMM平均16.8個(gè)（9-24個(gè)），分

7、選后BFU-E平均63.2個(gè)（35個(gè)-94個(gè)），CFU-GM平均16.2個(gè)（17-42個(gè)），CFU-GEMM平均8.2個(gè)（8-17個(gè)），其中分選后CFU-GM、CFU-GEMM集落培養(yǎng)數(shù)量較分選前明顯減少，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。
　　5.分選前后細(xì)胞體外抗血液系統(tǒng)腫瘤活性：分選前后造血干細(xì)胞產(chǎn)物分別與K562/Jurkat/U-266/HL-604種血液腫瘤細(xì)胞株共培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)分選后的細(xì)胞產(chǎn)物較分選前其體外抗血液腫瘤效應(yīng)

8、無明顯減弱（P＞0.05），在K562效靶比40：1以及Jurkat5:1的效靶比下，P＜0.05，這種情況可能與樣本量過少有關(guān)。
　　6.分選前后細(xì)胞體外抗CMV/EBV/曲霉菌病原體活性：分選前后外周血干細(xì)胞產(chǎn)物經(jīng)EBV/CMV/曲霉特異性抗原刺激后流式檢測CD4+/CD8+細(xì)胞IFN-γ分泌量同時(shí)ELISA檢測刺激前后細(xì)胞上清液中的IFN-γ的分泌量，我們發(fā)現(xiàn)分選后的干細(xì)胞產(chǎn)物體外抗病原體活性較分選前外周血干細(xì)胞并無明顯減弱

9、，部分甚至增強(qiáng)了對EBV/CMV/曲霉抗病原體活性。
　　7.供受者混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：隨著反應(yīng)細(xì)胞與刺激細(xì)胞比例的增加，反應(yīng)細(xì)胞對刺激細(xì)胞的反應(yīng)增加，增殖加快。同一比例下，分選前后兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分選后的細(xì)胞產(chǎn)物體外對患者自身細(xì)胞反應(yīng)較分選前減低，P＜0.05，但在效靶比1:1的情況下P＞0.05，這可能與樣本數(shù)量過少有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.體外使用CD45RA磁珠能有效地清除PBSCs中的CD45RA+細(xì)胞，