人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與染色體核型分析

1、<p><b>　　西南大學(xué) </b></p><p>　　《細(xì)胞生物學(xué)自主實(shí)驗(yàn)》課程論文</p><p>　　論文題目：人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與染色體核型分析</p><p><b>　　學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院</b></p><p><b>　　專業(yè)：生物科學(xué)</b>

2、</p><p>　　年級班級：2010級5班</p><p><b>　　校區(qū)編碼：北區(qū)</b></p><p>　　學(xué)號：222010317011128</p><p><b>　　姓名：陳建坤</b></p><p>　　二零一二年十二月四日</p>&l

3、t;p>　　人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與染色體核型分析</p><p>　　10級生科5班3組 陳建坤 學(xué)號：222010317011128</p><p>　　【摘要】：染色體是遺傳物質(zhì)的載體，它具有貯存和傳遞DNA、控制基因活動和調(diào)整基因重組的作用。本文著重介紹通過對人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與染色體核型分析，初步了解到對人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法與人類體細(xì)胞染色

4、體核型分析的方法。該實(shí)驗(yàn)采用人工離體培養(yǎng)的方法，采集人體外周血淋巴細(xì)胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞而進(jìn)行有絲分裂）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)過（72±2）恒溫培養(yǎng)，秋水仙素處理、低滲和固定，獲得大量有絲分裂中期細(xì)胞。最后經(jīng)過空氣干燥法制片，對人體外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析。</p><p>　　【關(guān)鍵字】：人體外周血淋巴細(xì)胞 染色體核型 人工離體培養(yǎng) &l

5、t;/p><p><b>　　一．引言:</b></p><p>　　染色體是遺傳物質(zhì)的載體，它具有貯存和傳遞DNA、控制基因活動和調(diào)整基因重組的作用。人類染色體核型分析是將人的一個(gè)體細(xì)胞有絲分裂中期的染色體，在技術(shù)的基礎(chǔ)上，按照染色體的大小和形態(tài)特征（主要根據(jù)著絲點(diǎn)位置），對染色體進(jìn)行分組、排隊(duì)和配對。這對于探索人類遺傳病的發(fā)病機(jī)理，探討動物和植物的起源，以及物種間的親

6、緣關(guān)系等都具有重要意義。直到上世紀(jì)50年代，科學(xué)家對染色體本身的細(xì)致深入研究才成為可能。染色體組型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間，人類G顯帶核型圖譜關(guān)系所不可缺少的重要手段。1952年徐道覺用低滲法使細(xì)胞膨脹，使染色體充分分散開來。1956年，Tjio等用秋水仙素使細(xì)胞分裂固定在分裂中期，增加了細(xì)胞分裂相。之后，有科學(xué)家建立了人體外周血培養(yǎng)法，使得染色體取材變得更加容易，大大推動了人類

7、對染色體的研究。</p><p>　　二．人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與染色體核型分析</p><p>　　1.實(shí)驗(yàn)依據(jù)：1.1.細(xì)胞培養(yǎng)是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機(jī)體中取出的細(xì)胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸

8、堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。</p><p>　　1.2.染色體是組成細(xì)胞核的基本物質(zhì), 是基因的載體。 人類細(xì)胞遺傳學(xué)研究的主要對象是染色體。本實(shí)驗(yàn)采用了微量全血培養(yǎng)技術(shù)，既方便又節(jié)省人力物力。在正常情況下, 人外周血中是沒有分裂相的, 只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn)。 植物血細(xì)胞凝集素(PHA) 是人類淋巴細(xì)胞有絲分裂的刺激劑,在 PHA 作用下, 原處于 G0期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞, 進(jìn)而進(jìn)行

9、有絲分裂。 利用 PHA 這一特性, 淋巴細(xì)胞經(jīng)過含有 PHA 培養(yǎng)液培養(yǎng), 在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細(xì)胞群體, 終止分裂中期的淋巴細(xì)胞, 經(jīng)過短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可獲得大量的中期有絲分裂細(xì)胞。最后經(jīng)空氣干燥法制片，便可得到質(zhì)量較好的染色體標(biāo)本。即可得到所需的人體染色體圖形。</p><p>　　染色體組型，又稱核型，是指將動物、植物、真菌等的某一個(gè)體或某一分類群（亞種、種、

10、屬等）的體細(xì)胞內(nèi)的整套染色體，按它們相對恒定的特征排列起來的圖像。核型模式圖，是指將一個(gè)染色體組的全部染色體逐個(gè)按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像。</p><p>　　染色體組型分析就是通過對染色體標(biāo)本和其照片進(jìn)行測量、對比分析、配對、分組、排列，對各染色體的形態(tài)進(jìn)行分析。在細(xì)胞遺傳學(xué)、現(xiàn)代分類學(xué)、生物進(jìn)化和遺傳育種學(xué)等研究中，是重要的研究手段。</p><p>　　1

11、.3.對于任何一個(gè)染色體的基本形態(tài)特征來說，重要的參數(shù)有以下3個(gè)：</p><p>　?。?）相對長度=單條染色體的長度/(單倍體常染色體+X或Y染色體)的總長度×100%</p><p>　　（2）臂指數(shù)=長臂/短臂 （反映著絲粒位置的指數(shù)）</p><p>　?。?）著絲粒指數(shù)=短臂/整個(gè)染色體長度×100%（反映著絲粒位置的指數(shù)）</

12、p><p>　　人類體細(xì)胞的正常核型是含有23對染色體，共46條。其中22對是男女共有的染色體，一對為男女所不同的性染色體，男XY,女XX。</p><p>　　表-1 人類染色體組型</p><p>　　正常男性染色體核型 正常女性染色體核型</p><p>　　3、實(shí)驗(yàn)儀器試劑及材料：&l

13、t;/p><p><b>　　3.1.材料：</b></p><p>　　人的靜脈外周血. （組內(nèi)選取男女各一名，取血樣）</p><p><b>　　3.2.試劑：</b></p><p>　　RPMI-l640培養(yǎng)粉 NaHCO3 NaCl PHA(植物血球凝集素) 肝素 青鏈霉素&l

14、t;/p><p>　　小牛血清 秋水仙素 95%酒精 冰乙酸 甲醇 甘油 Giemsa粉末</p><p><b>　　3.3.器材： </b></p><p>　　恒溫培養(yǎng)箱,電冰箱,高壓滅菌鍋,離心機(jī),真空泵,分析天平,顯微鏡,超凈工作臺,注射器,離心管,培養(yǎng)瓶,試管架及試管,量桶,燒杯,酒精燈,抽濾瓶,G6型號細(xì)菌過濾漏

15、斗，染缸，滴管等。</p><p><b>　　4、實(shí)驗(yàn)方法：</b></p><p>　　4.1.各種試劑及培養(yǎng)基的配制 </p><p>　　(1)RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制：稱取RPMI-l640培養(yǎng)粉9.8g溶于1,000mL蒸餾水中,經(jīng)G6型號細(xì)菌過濾漏斗中0.22微米的濾膜抽濾后備用。使用前最好做熱源培養(yǎng)以確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

16、</p><p>　　(2)5%NaHCO3的配制：稱取5gNaHCO3,溶于100mL蒸餾水中,高壓滅菌備用. </p><p>　　(3)生理鹽水的配制：稱取0.85gNaCl溶于l00mL蒸餾水中高壓滅菌備用. </p><p>　　(4)PHA(植物血球凝集素)的配制：稱取PHA50mg配制成濃度為lmg/mL(生理鹽水配制)的溶液.由于PHA使用量較少,配

17、制時(shí)使用注射器式無菌過濾器,以減少藥品損失. </p><p>　　(5)肝素溶液的配制：40ml生理鹽水溶解粉末160mg（每mg含126單位），配制成500單位/ml，8磅15min滅菌。</p><p>　　(6)雙抗溶液的配制：將青鏈霉素用生理鹽水按效價(jià)單位配成l0萬單位/mL,配制過程要求使用注射器式無菌過濾器.</p><p>　　(7)秋水仙素溶液的配

18、制：用生理鹽水配制成濃度為40（微克/mL）秋水仙素溶液,使用注射器式無菌過濾器進(jìn)行除菌操作. </p><p>　　(8)低滲液溶液的配制：稱取5.59gKCl溶于1000mL雙蒸餾水中,配制成溶液濃度為0.075mol/L的低滲液溶液.</p><p>　　(9)細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入RPMIl640基礎(chǔ)培養(yǎng)基4mL,小牛血清lmL,肝素3滴（0.03ml）,PHA4滴（

19、0.4 ml）, 加入雙抗5滴（0.05ml）,NaHCO3調(diào)pH至7.2～7.4.</p><p>　?。?0）固定液的配制：9ml純酒精+3ml冰乙酸</p><p>　　（11）Giemsa（吉姆斯）染液（不用配）</p><p>　　Giemsa原液配制：稱Giemsa粉末0.5g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油總量為33ml）。56℃中保溫90～

20、120min。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。</p><p><b>　　4.2實(shí)驗(yàn)操作方法</b></p><p>　　1、實(shí)驗(yàn)所用藥品及器皿的無菌處理 </p><p>　　(1) 實(shí)驗(yàn)用的所有器皿,器具都必須按規(guī)定洗凈,高壓滅菌處理備用. </p><p>　　(2) 實(shí)驗(yàn)用全部藥品都要經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌處理

21、.具有生物活性的藥品要經(jīng)G6型號細(xì)菌過濾漏斗抽濾除菌,其它藥品可經(jīng)過高壓滅菌。</p><p>　　2.采取血樣：去校醫(yī)院取本組男生和女生各2份血樣。在無菌條件下，向含有3mlRPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中接種0.18 ml全血，輕輕搖勻。</p><p>　　3.血細(xì)胞培養(yǎng)：將4瓶裝有血細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66～72h（在培養(yǎng)期間每天搖動兩次），終止培養(yǎng)前3～4h加入秋

22、水仙素15ml，使最終濃度為0.4～0.8ug/ml。</p><p>　　4.收集細(xì)胞：將培養(yǎng)瓶從溫箱取出，用吸管將貼壁細(xì)胞沖散均勻，按下表將液體分裝在相應(yīng)的離心管中，以1000rpm/min離心8min，棄上清液。</p><p>　　5.低滲處理：先加入1ml 0.075mol/L KCl溶液，輕輕吹打，使細(xì)胞重懸，然后補(bǔ)加6ml KCl溶液，37℃低滲20min。（使紅細(xì)胞脹破，白

23、細(xì)胞脹大，染色體空間變大，易伸展，便于觀察）</p><p>　　6.預(yù)固定：沿管壁慢慢加入1ml新配carnoy氏固定液，輕輕吹打混勻，1000rpm/min離心8min，去上清液。</p><p>　　7.固定：沿管壁慢慢加入6ml固定液，固定兩分鐘后再吹打，用吸管輕輕地吹打，使細(xì)胞分散，固定20min，離心去上清夜。</p><p>　　8.重復(fù)固定：取上清液

24、，再重復(fù)進(jìn)行7過程。</p><p>　　9.滴片：沉淀物中加入6滴固定液，用吸管吹打使其成為細(xì)胞懸液；用鑷子取預(yù)先冰凍的干凈載玻片，迅速滴上2～3滴細(xì)胞懸液，立即用嘴向同一方向吹氣，使細(xì)胞分散均勻，然后置酒精燈上微微加熱干燥（或空氣干燥）。</p><p>　　10.染色：滴有細(xì)胞懸液的載片反扣在染色板上，使片、板之間有一縫隙，將稀釋后的Giemsa染液滴在片隙中，染色20min（或放于

25、染缸中）；自來水沖洗，吹干。</p><p>　　11.鏡檢：在低倍鏡找到處于中期分裂相的細(xì)胞，然后在轉(zhuǎn)至高倍鏡下觀察.觀察時(shí)要使用推進(jìn)器座標(biāo)尺記錄分散良好的細(xì)胞位置，便于重新查找，選擇染色體分散好、長度適中、姐妹染色單體清楚的中期分裂相進(jìn)行顯微觀察。人類每個(gè)體細(xì)胞有46條染色體，根據(jù)染色體的長度和著絲粒位置的不同，可以分成22對常染色體和一對性染色體，男子是46，XY；女子是46，XX。</p>

26、<p>　　12.染色體組型分析：</p><p>　　(1)在顯微鏡下找出染色體分散良好、長度適中、姐妹染色單體清楚的中期分裂相進(jìn)行顯微拍攝。</p><p>　　(2)將顯微拍攝放大的照片上的一個(gè)細(xì)胞的全部染色體分別一條一條剪下。</p><p>　　(3)根據(jù)染色體的長短和形態(tài)特征進(jìn)行同源染色體的目測配對。</p><p&g

27、t;　　(4)測量出每條染色體短壁和長臂長度，計(jì)算出各條染色體的相對長度、著絲粒指數(shù)、臂指數(shù)，記錄原始數(shù)據(jù)。</p><p>　　(5)根據(jù)測量數(shù)據(jù)校正目測配對排列結(jié)果，進(jìn)行調(diào)整排列。</p><p>　　(6)把染色體按一定順序一對一對的排列，排列時(shí)注意短臂向上，長臂向下，性染色體單獨(dú)排列，最后把染色體貼成一完整的染色體核型圖。</p><p><b&

28、gt;　　(7)翻拍。</b></p><p><b>　　5．實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析</b></p><p>　　5.1.本實(shí)驗(yàn)采用國際標(biāo)準(zhǔn)，使用兩種方法，依照上表各指標(biāo)分析染色體組型，擬圖，結(jié)</p><p><b>　　果如下</b></p><p>　　男性染色體核型 （PS）

29、 女性染色體核型 （PS）</p><p>　　男性染色體核型（手工） 女性染色體核型（手工）</p><p>　　5.2.數(shù)據(jù)處理：見下表 男性</p><p><b>　　女性：</b></p><p>　　5.3.根據(jù)上面的實(shí)

30、驗(yàn)圖示以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：論采用何種方式處理方式（PS或手工），均得到相同的人體染色體組型，人體正常細(xì)胞核型含46條染色體，相互配對成23對。其中22對為男女共有的常染色體。另一對男XY，女XX為男女所獨(dú)有的，決定性別的性染色體。</p><p>　　5.4.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每個(gè)培養(yǎng)瓶中均出現(xiàn)血細(xì)胞凝集現(xiàn)象，定期的搖動可以將其分散。然而男1培養(yǎng)瓶由于搖動的時(shí)間以及次數(shù)比較少，出現(xiàn)了凝集成血塊狀的沉淀，但是并沒有

31、對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響。在后期的試驗(yàn)中仍可拍到很好地圖像,如上圖男性染色體核型(ps）所示.</p><p>　　5.5.根據(jù)實(shí)驗(yàn)所拍到的圖像可得知，女2②號、男2②培養(yǎng)瓶所拍到的染色體的分散程度比其他培養(yǎng)瓶的較好。表明低滲的處理時(shí)間會對染色體的分散程度產(chǎn)生影響，低滲25min的效果比低滲20min的效果好。</p><p>　　5.6.相比其他組所拍到的染色體，我們組的染色體明顯較短。原

32、因是①其他組加入秋水仙素的時(shí)間比我們早，他們的染色體大多是處于分裂晚前期和早中期；②我們組加的秋水仙素的量比較多，對染色體產(chǎn)生了影響。</p><p>　　6．影響實(shí)驗(yàn)的事項(xiàng)：</p><p>　　6.1.外周血的采集：采血接種時(shí)不要加入太多的肝素。肝素過多可能引致溶血和一些淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和分裂。接種時(shí)，若血液過少，獲得的淋巴細(xì)胞少；而接種過多，淋巴細(xì)胞增殖不良，染色體稀少。</p&g

33、t;<p>　　6.2.培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的質(zhì)量在影響染色體質(zhì)量方面最為關(guān)鍵，從營養(yǎng)不良的培養(yǎng)基中獲得的細(xì)胞所制備的染色體質(zhì)量差，不利于染色體核型分析。</p><p>　　6.3. 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)階段也是極為關(guān)鍵的一步，細(xì)胞的旺盛生長與培養(yǎng)時(shí)間、溫度、CO2濃度等條件。培養(yǎng)時(shí)間以（72±2）h為宜，時(shí)間過長或過多，得到的染色體質(zhì)量都不符合要求。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的適宜溫度為（36±0

34、.5）℃ ，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。 如果溫度高于37℃,細(xì)胞的生長速度減慢；如果溫度高于40℃ ，細(xì)胞受損，超過43℃，則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。氣體是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有O2、CO2。CO2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值。 大多數(shù)細(xì)胞的適宜PH為7.2～7.4,培養(yǎng)基的PH值也應(yīng)調(diào)整到7.2～7.4偏離這一范圍對細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害

35、的影響。 偏酸性時(shí)細(xì)胞發(fā)育不良，偏堿性時(shí)細(xì)胞會出現(xiàn)輕度固縮。培養(yǎng)箱的溫度和CO2 濃度應(yīng)嚴(yán)格控制在(37 ±0.5）℃ 、5％ 以獲得良好的中期分裂相。</p><p>　　6.4. 秋水仙素與作用時(shí)間：秋水仙素作為細(xì)胞培養(yǎng)中的紡錘體阻斷劑，可使分裂象細(xì)胞停留在分裂中期而獲得大量分裂中期染色體以便于核型分析。加入秋水仙素的劑量、作用時(shí)間與處于分裂中期細(xì)胞數(shù)量、染色體長短密切相關(guān)。加入的秋水仙素過量、作用

36、時(shí)間過長，染色體濃縮，不利于分析；若加入的秋水仙素量不足、作用時(shí)間過短，則染色體細(xì)長或無染色體，同樣不利于核型分析。只有適量的秋水仙素與適量的作用時(shí)間，才能獲得較好的分裂象。</p><p>　　6.5. 離心力與低滲時(shí)間：將培養(yǎng)物收集到15 ml的離心管中，通過離心獲得需要的細(xì)胞。整個(gè)過程中，離心力的大小很關(guān)鍵。離心力過大會導(dǎo)致細(xì)胞之間粘連過緊，低滲時(shí)細(xì)胞不能被充分混勻，影響低滲效果。用滲透壓很低的鹽溶液或蒸餾

37、水處理活細(xì)胞，使得細(xì)胞長大而不破裂，使得最后制成的片子染色體充分散開。低滲處理的時(shí)間過長或過短，都不利于后期染色體的分散，一般以20～25min分鐘為宜。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　1、李國珍：染色體及其研究方法. 科學(xué)出版社. 1985. 第170-176頁</p><p>　　2、劉國章等：198

38、7. 遺傳，9(3): 26-27.</p><p>　　3、陳心陶: 醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)(修訂第二版).人民衛(wèi)生出版社. 1965.第330-333頁.</p><p>　　4、李紅燕，王金富． 禽類染色體組型研究進(jìn)展【J】.畜牧生產(chǎn). 2006．15 (3 )： 25 -27.</p><p>　　5、吳艷萍. 核型異常與疾病關(guān)系的分析【J】.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)． 2007