hBcl-2基因修飾骨髓基質細胞對體外培養(yǎng)PC12細胞保護作用的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：H2O2對PC12細胞活性影響的實驗研究
　　 由于腦組織幾乎沒有供能物質儲備，全部依靠血液循環(huán)帶來的氧、葡萄糖來維持和執(zhí)行正常的生理功能。腦組織對缺氧異常敏感，并且容易產(chǎn)生氧化應激損傷，其中氧自由基在氧化應激損傷中起到了重要的作用。H2O2在實驗中常用來模擬氧自由基的作用，而PC12細胞在實驗研究中可以作為神經(jīng)元的替代細胞。PC12是來源于嗜鉻細胞瘤的細胞株易培養(yǎng)可傳代，作為神經(jīng)元的

2、替代細胞是一個比較理想的細胞模型。
　　 目的：研究H2O2對PC12細胞活性的影響。
　　 方法：培養(yǎng)PC12細胞，當細胞貼壁約70％時用手拍打培養(yǎng)瓶讓細胞到培養(yǎng)液中，用移液器把細胞吹散。轉移適量的細胞到新的培養(yǎng)器皿中傳代，搖晃均勻制成細胞懸液，將PC12細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，調節(jié)PC12的密度為2×105ml。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，依次分為5組，加入PC12細胞培養(yǎng)基后，分別加入不同劑量

3、的H2O2 使其終濃度分別為(0、50、100、150、250、300nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)8小時。8小時后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后用MTT法檢測細胞活力。另一方面我們用250nmol/L的H2O2分別處理PC12細胞0、2、4、6、8、10小時后更換培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后用MTT法檢測細胞活力。
　　 結果：不同濃度的H2O2對PC12細胞的活性有不同的影響，當用50nmol/L的H2O2處理PC12細胞8小時，其活

4、性輕度增加(P<0.05)；當處理時間不變H2O2濃度的進一步提高時(濃度波動于100-300nmol/L 范圍時)，PC12細胞活性則受到明顯的抑制,當H2O2 達到300nmol/L時,大多數(shù)PC12細胞死亡(P<0.01)。
　　 當用250nmol/L的H2O2 作用于培養(yǎng)的PC12細胞不同的時間段，PC12細胞活力隨時間依賴性下降，從處理6小時起始有統(tǒng)計意義(P<0.05)，PC12細胞活力較對照組相比有所下降。250

5、nmol/L的H2O2 作用于培養(yǎng)的PC12細胞8小時,導致PC12細胞活性約為對照組的50％(P<0.05)，處理10小時PC12細胞活性明顯下降(P<0.01)。
　　 結論：不同濃度的H2O2對PC12細胞的活性有不同的影響，低濃度的H2O2處理8小時對PC12細胞活力有一定的促進作用，而中高濃度的H2O2 作用8小時PC12細胞的活力下降，H2O2 濃度越高及處理時間越長，PC12細胞的活力下降越明顯。
　　 第

6、二部分：hBcl-2基因修飾骨髓基質細胞對體外培養(yǎng)PC12細胞保護作用的研究
　　 近年來，利用神經(jīng)干細胞進行腦卒中治療是實驗研究中的熱點，而在神經(jīng)干細胞的研究中，骨髓基質細胞由于來源廣泛沒有社會倫理的限制得到了廣泛的應用。本試驗利用基因hBcl-2轉染骨髓基質細胞構建了MSCs-hBcl-2基因工程細胞，并觀察其對體外培養(yǎng)的氧化損傷的PC12細胞的保護作用。
　　 目的：觀察hBc l-2基因修飾的骨髓基質細胞對體外培

7、養(yǎng)PC12細胞的作用。
　　 方法：采用密度梯度離心結合貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠骨髓基質細胞、并利用其獨特的免疫學標志作鑒定。利用脂質體轉染的方法將pcDNA3-hBcl-2轉染MSCs 構建MSCs-hBcl-2基因工程細胞。轉染后用G418 進行陽性細胞篩選，并搜集MSCs-hBcl-2基因工程細胞培養(yǎng)上清。將PC12細胞接種于96孔板中并分為4組(①MSCs-hBcl-2組、②MSCs組、③MSCs 空質粒組、④空白對照組)，

8、分別加入MSCs-hBcl-2 培養(yǎng)上清液、MSCs 培養(yǎng)上清液、MSCs 空質粒培養(yǎng)上清液和PC12 培養(yǎng)基。使培養(yǎng)上清液的體積百分比為10％。然后使在H2O2 終濃度250nmol/L 作用下繼續(xù)培養(yǎng)8小時。用MTT法檢測吸光度(A)值及TUNEL檢測細胞調亡的方法來觀察MSCs-hBcl-2基因工程細胞的培養(yǎng)上清對PC12細胞的影響。
　　 結果：成功的培養(yǎng)出MSCs，對傳代的骨髓基質細胞進行免疫組化CD44、CD71染色

9、結果顯示所有細胞的胞漿或胞膜有棕黃色顆粒，提示其CD44、CD71表面標志表達陽性。將hBcl-2基因成功的轉染了MSCs 構建了MSCs-hBcl-2基因工程細胞，用G418 篩選后發(fā)現(xiàn)轉染后的細胞均有hBcl-2 蛋白的表達。氧化損傷的PC12細胞中加入各組細胞培養(yǎng)上清液后對其有一定的保護作用，不同的細胞培養(yǎng)上清液對PC12細胞的保護作用不同，MSCs-hBcl-2組保護作用最強(P<0.01)。
　　 MSCs組有一定的保

10、護作用(P<0.05)，MSCs-hBcl-2組較MSCs組具有更強的保護作用(P<0.05)。MSCs-hBcl-2組較MSCs組的TUNEL 陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。MSCs組與對照組相比TUNEL 陽性細胞數(shù)減低(P<0.05)。MSCshBcl-2組與對照組相比TUNEL 陽性細胞數(shù)明顯減低(P<0.01)。
　　 結論：MSCs-hBcl-2基因工程細胞的培養(yǎng)上清對PC12細胞的保護及抗調亡作用比骨髓基質細